6. Bố cục của luận án
1.4. Đánh giá tình hình nghiên cứu cây mật nhân
Từ những thông tin tổng hợp ở trên cho thấy, nghiên cứu về cây mật nhân, đặc biệt là rễ của chúng đã được triển khai và công bố ở nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam chúng ta. Nhiều hợp chất mới được phát hiện trong thành phần hóa học và nhiều đặc tính dược lý có giá trị đã được khảo sát và công bố trên các tạp chí khoa học uy tín. Rất nhiều nước trên thế giới đã công bố các sản phẩm thực phẩm hỗ trợ sức khỏe được chế biến từ mật nhân, trong đó có Mỹ, một số nước châu Âu, Nhật,
Singapore, Malaysia.v.v... [75].
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về mật nhân đã công bố tương đối nhiều, kết quả được thực hiện trên nhiều nguồn nguyên liệu trên cả nước. Tuy nhiên, đa phần là những nghiên cứu quy mô nhỏ, dưới dạng các bài báo khoa học chuyên ngành, chưa có nghiên cứu nào mang tính hệ thống và tính định hướng từ khảo sát nguyên liệu, chiết tách, thăm dò hoạt tính sinh học và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt đối với mật nhân tại khu vực miền Trung và Tây Nguyên, mặc dù thực tế, rễ cây mật nhân được bày bán khá phổ biến, đặc biệt là ở Quảng Nam, Huế và Gia Lai. Bên cạnh đó, trên thị trường đã có một số sản phẩm dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ loài cây này, tuy nhiên, hiện chưa nhiều các sản phẩm ứng dụng mật nhân được sản xuất và kinh doanh mang tính thị hiếu vừa có tác dụng hỗ trợ sức khỏe, vừa có chức năng giải khát.
Chính vì vậy, với mong muốn bảo tồn và sử dụng nguồn gen quý cây mật nhân tại Tây Nguyên, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn dữ liệu về loại thảo dược tại v ng này, đa dạng sản phẩm thực phẩm có tính ứng dụng, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần
hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) ở khu vực miền Trung - Tây
Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với những nội dung nghiên cứu
cụ thể sau:
- Khảo sát khả năng kháng độc tế bào ung thư, kháng oxy hóa của dịch chiết rễ
cây mật nhân ở huyện Phước Sơn - tỉnh Quảng Nam và huyện Ia Grai - tỉnh Gia Lai nhằm đánh giá, lựa chọn nguồn nguyên liệu rễ cây mật nhân phục vụ nghiên cứu.
- Phân lập các hợp chất từ các cao chiết dung môi phân cực, phân cực trung
bình và ít phân cực Định danh các hợp chất đã phân lập, xác định thành phần, cấu trúc hóa học của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid và những hợp chất không thuộc nhóm alkaloid.
- Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng quy trình chiết trong dung môi nước và
ethanol 80 % để xây dựng các quy trình chiết tách, từ đó, sản xuất cao chiết mật nhân và bột mật nhân để bổ sung vào quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe.
- Thăm dò hoạt tính kháng độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng vi sinh vật
kiểm định, kháng oxy hóa, thử độc tính bất thường, khả năng gây độc tế bào người của dịch chiết rễ cây mật nhân.
- Ứng dụng mật nhân để sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đánh giá
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
2.1.1.Thu hái và định danh mẫu rễ cây mật nhân
Mẫu rễ cây mật nhân được thu hái tại v ng đồi núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam, các vùng này có rất nhiều loại cây dược liệu có giá trị.
Phương pháp lấy mẫu thực vật: Rễ cây mật nhân được thu hái và lấy mẫu để nghiên cứu theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8551:2010 – Cây trồng – Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu.
Rễ cây mật nhân được định danh tại phòng sinh học và được lưu trữ mẫu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam.
2.1.2.Xử lý nguyên liệu
Rễ cây mật nhân được xử lý loại bỏ tạp chất, bụi bẩn, rửa rồi phơi khô, sau khi phơi khô có m i thơm đặc trưng Tiến hành chẻ nhỏ thành lát mỏng rồi sấy ở nhiệt độ 60 oC trong 24 giờ, độ ẩm khoảng (10 ÷ 12) %, xay nhỏ dạng bột với kích thước từ (0,5 ÷ 1) cm, đóng gói, bảo quản ở điều kiện thường trong phòng thí nghiệm để đưa vào nghiên cứu [83].
a. Chưa qua xử l b Sau khi cắt nhỏ c Bột rễ mật nhân
Hình 2.1. Một số hình ảnh của rễ mật nhân
Nguyên liệu chính sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Cỏ ngọt, la hán quả và cam thảo khô được mua tại nhà thuốc Đông y tại thành phố Đà Nẵng. Nụ vối được thu hái tại v ng đất trồng ở Tràng An, Ninh Bình và được phơi khô Rau má được mua tại siêu thị ở Đà Nẵng.
2.2.1.Hóa chất, vật tư
Một số hóa chất, vật tư chính d ng trong nghiên cứu như sau: - Ethanol, xuất xứ: Việt Nam, độ tinh khiết: 96%
- Methanol, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9% - n-Hexane, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9% - Ethyl acetate, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9% - Maltodextrin, xuất xứ: Trung Quốc, DE từ 10 ÷ 15
- Đường tinh luyện, xuất xứ: Việt Nam, độ tinh khiết: 99,8%, độ màu ≤ 20 Icumsa.
- Pectin, xuất xứ: Đức, HMP, DE > 50%, MI > 7%, DA = 0
Một số hóa chất, vật tư khác d ng trong nghiên cứu được nêu ở Phụ lục 1.
2.2.2.Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu như sau: - Cân phân tích, d = 0,0001 g (Model: TDX-A300, Marcus, Đức ; - Tủ sấy Model: UNB-400, Memmert, Đức ;
- Sắc k lớp mỏng: Bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel Meck 60 F254, dày 0,2 mm Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254 nm và 365 nm, thuốc thử hiện màu vanilin/H2SO4 (vanilin 1,2 g; MeOH 200 mL; CH3COOH 25 mL; H2SO4 11 mL);
- Sắc k cột thường: Silicagel cỡ hạt 197 – 400 mesh (0,040 mm – 0,063 mm) cho cột đầu, sắc k cột nhanh: Silicagel cỡ hạt 70 – 200 mesh, sắc k cột pha đảo: RP- 18, sắc k lọc gel: sephadex LH-20 Merck, nhựa Dianion HP-20.
- Thiết bị cô quay chân không Model: Hei-VAP precision, Heidolph, Đức ; - Hệ thống sắc k lỏng hiệu năng cao HPLC Model: Hitachi, Nhật ;
2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu
Rễ cây mật nhân Phân lập, xác định thành phần, cấu trúc hóa học Trà thảo mộc mật nhân Nước rau má mật nhân Chiết phân đoạn
Tinh chế, làm sạch
Định danh, xác định cấu trúc
Sản xuất cao chiết mật nhân
Thăm dò hoạt tính sinh học:
Kháng tế bào ung thư, kháng
viêm, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng sinh
Thử độc tính bất thường, độc tính
với tế bào người
Bổ sung cao mật nhân Đánh giá cảm quan
Đánh giá ATVSTP
Xây dựng quy trình chiết:
Lựa chọn phương pháp chiết
và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết
Tối ưu hóa một số yếu tố
ảnh hưởng quy trình chiết trong dung môi nước và ethanol 80 % Dịch chiết nước Dịch chiết ethanol 80 % Đánh giá ATVSTP Đánh giá cảm quan Đánh giá ATVSTP Bổ sung bột mật nhân Sản xuất bột mật nhân Khảo sát, lựa chọn nguyên
liệu nghiên cứu
Công bố chất lượng
Công bố chất lượng
Rễ cây mật nhân được thu nhận từ vùng núi huyện Ia Grai - tỉnh Gia Lai và vùng núi huyện Phước Sơn - tỉnh Quảng Nam, nguyên liệu được khảo sát, đánh giá, lựa chọn nhằm sử dụng cho toàn bộ quá trình nghiên cứu. Rễ cây mật nhân được xử lý sơ bộ, xay nhỏ thành bột, sau đó, chiết trong các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau tạo thành dịch chiết để phân lập và định danh, xác định thành phần hóa học, cấu trúc hóa học của các hợp chất. Từ kết quả đó, chúng tôi nghiên cứu chọn hàm mục tiêu để tối ưu hóa các thông số nhằm xây dựng quy trình chiết. Ngoài ra, chúng tôi khảo sát hoạt tính sinh học các dịch chiết thu được để làm cơ sở cho quá trình ứng dụng bổ sung trong quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng ở mô phòng thí nghiệm, đánh giá chất lượng và an toàn thực phẩm của các sản phẩm thu được. Sản xuất cao chiết mật nhân và bột mật nhân để bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đánh giá cảm quan, an toàn thực phẩm, thời gian bảo quản và công bố chất lượng sản phẩm.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm
2.4.1. Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu
Các tiêu chí được sử dụng để đánh giá, lựa chọn nguyên liệu bao gồm:
- Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học và các chỉ tiêu hóa l được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng với các phương pháp phân tích sau:
Phương pháp lấy mẫu thực vật: TCVN 8551:2010
Phương pháp xác định hàm lượng protein: TCVN 8125:2015 Phương pháp xác định hàm lượng lipit: TCVN 6555:2017 Phương pháp xác định hàm lượng xơ thô: TCVN 5103:1990 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng: KT2 K2 TN-15/TP Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng: AOAC 999 11 - Sàng lọc một số hoạt tính sinh học của dịch chiết như:
Thử khả năng kháng độc tế bào ung thư: Sử dụng phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp [29]. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện sinh học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
Thử khả năng kháng oxy hóa: Sử dụng phương pháp đánh giá thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết vì
điều kiện thực hiện thuận lợi và gần đây có nhiều tác giả đã chọn phương pháp này [35]. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng.
Từ kết quả nghiên cứu và sàng lọc, vùng nguyên liệu được lựa chọn để thu nhận rễ mật nhân nhằm thực hiện các công đoạn nghiên cứu tiếp theo.
2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân mật nhân
2.4.2.1. Phân lập các hợp chất hóa học
a. Nhóm hợp chất alkaloid
Hình 2.3. Sơ đồ chƣng cất tạo cao chiết nƣớc
Rễ mật nhân
Chưng ninh hồi lưu
Lọc
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0
C, số vòng quay: 40 vòng/phút
Cao chiết nước Nước + Nhiệt độ: 70 oC + Thời gian: 120 phút + Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20 mL/1 g Bã
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất nhóm alkaloid
Tiến hành chưng ninh hồi lưu trong nước 4 kg bột rễ cây mật nhân ở nhiệt độ 70 oC trong 120 phút với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20 mL/g theo sơ đồ hình 2.3. Sau khi loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô quay chân không thu được 40 g cặn chiết nước. Cho 40 g cặn chiết nước qua hệ thống sắc ký cột với chất hấp phụ là Diaion đường kính cột d = 60 mm; chiều dài lớp Diaion l = 800 mm); hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2); MeOH:H2O (5:5) và MeOH 100 %, thu được 15 nhóm phân đoạn chính, ký hiệu từ F1 đến F15.
SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải 100%
H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2);
MeOH:H2O (5:5) và MeOH 100%thu được
15 phân đoạn F1-F15)
Cao chiết nước (40 g)
F8 (1,7 g) (F8 + F9)
SKC silicagel, hệ dung
môi CH2Cl2:MeOH
98:2 tăng dần đến 1:1), thu được 19 phân đoạn
F3 (17 g) (F3 + F7)
SKC silicagel, hệ dung
môi CH2Cl2:MeOH
95:5 tăng dần đến tỷ lệ 1:1 , thu được 14 phân đoạn EL1B (10 mg) (trắng) EL1C (5 mg) (trắng) F8.12.1 ...F8.12.7 chọn F8.12.3 F3.1 ... F3.15 chọn F3.2 (1,2 g)
SKC silicagel, hệ dung môi
CH2Cl2:MeOH 9:1tăng dần
đến 1:1), rửa giải bằng hệ
dung môi MeOH:H2O (1:1),
thu được 15 nhóm phân đoạn
SKC Sephadex (2 lần) F3.2.1 ...F3.2.14 chọn F3.2.12 EL4 (6 mg) (vàng) F3.1 ...F3.15 chọn F3.6 (0,12 g) SKC Sephadex (2 lần) F3.6.1 ... F3.6.4 chọn F3.6.2 SKC silicagel, hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 , thu được 4 phân đoạn EL5 (6 mg) (trắng) F8.1 ...F8.19 chọn F8.12 (200 mg) SKC Sephadex, rửa giải bằng MeOH, thu được 7 phân đoạn
SKC Sephadex
Phân đoạn F8 và F9 được gộp lại ký hiệu F8 (1,7 g được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043 mm - 0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 98:2 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 19 phân đoạn, được ký hiệu là F8 1 đến F8 19 Phân đoạn F8 12 200 mg được tách qua sắc ký cột sephadex rửa giải bằng MeOH thu được 7 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F8.12.1 đến F8 12 7 Phân đoạn F8.12.3 sau hai lần được tách bằng sắc ký cột sephadex thu được 10 mg chất sạch rắn, màu trắng k hiệu là EL1B (chất 1) và 5 mg chất rắn màu trắng EL1C (chất 4).
Phân đoạn F3 và F7 được gộp lại ký hiệu F3 17 g và được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 9:1 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1 và cuối cùng rửa giải cột bằng hệ dung môi MeOH:H2O 1:1 , thu được 15 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F3.1 đến F3. 15.
Phân đoạn F3.2 (1.2 g được tách bằng sắc ký cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 95:5 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ F 3 2 1 đến F3.2.14.
Phân đoạn F3.2.12 (20 mg) sau hai lần qua cột Sephadex thu được 6 mg chất sạch dạng rắn màu vàng ký hiệu EL4 (chất 2). Phân đoạn F3.6 (0,12 g) tách bằng sắc ký cột silicagel hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 thu được 4 phân đoạn Phân đoạn F3.6.2 được tách bằng sắc k thu được 4 mg chất sạch màu trắng ký hiệu EL5 (chất 3).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết nước của rễ cây mật nhân được mô tả ở hình 2.3 và hình 2.4 [5].
b. Nhóm hợp chất khác
Hình 2.5. Sơ đồ tạo cao chiết n-henxane và cao chiết ethyl acetate
Rễ mật nhân
Chiết Soxhlet trong 24 giờ
Lọc
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0
C, số vòng quay: 40
Cao chiết n-hexane n-
hexane
Ngâm chiết với ethanol 85 % trong 3 giờ
Chiết trong ethyl acetate
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0
C, số vòng quay: 40
Cao chiết ethyl acetate Bả
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các chất không thuộc nhóm alkaloid
Tiến hành chiết Soxhlet trong n-hexane 3 kg bột rễ cây mật nhân trong 7 lít dung môi trong 24 giờ, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4,1 g cặn. Phần bã được ngâm chiết với ethanol 85 % 3 kg bã được chiết trong 8 lít dung môi trong 3 giờ), khuấy ở nhiệt độ 50 oC và tiếp tục để ngâm qua đêm Sau ba lần chiết, dịch chiết được lọc và quay cất dưới áp suất giảm đến thể tích khoảng 500 mL. Cho ethyl acetate vào, chiết phân lớp ba lần (mỗi lần 250 mL). Dịch chiết ethyl acetate được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 69,1 g cặn chiết ethyl acetate.
Cao chiết n-hexane 4,1 g được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn. Ở phân đoạn 6 thu được 6 mg một chất sạch màu vàng hình kim kết tinh được ký hiệu là MNH1 (chất 5).
Cao chiết ethyl acetate 35 g được phân tách bằng cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn ký hiệu từ