6. Bố cục của luận án
2.4.5. Nghiên cứu ứng dụng bổ sung mật nhân trong sản xuất một số thực phẩm
bảo vệ sức khỏe
2.4.5.1. Cơ sở bổ sung mật nhân vào sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe
Việc bổ sung mật nhân có thể dưới dạng cao chiết hoặc bột vào quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe phải đáp ứng mục tiêu: Vừa đảm bảo yêu cầu đối với hoạt chất được bổ sung để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, vừa phải đáp ứng chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm và thị hiếu người dùng, cụ thể như sau:
- Căn cứ pháp l : Đối với thành phần tạo nên công dụng của sản phẩm thực phẩm
bảo vệ sức khỏe, trong nội dung được quy định tại điều 10, Thông tư 43/2014/TT- BYT đã yêu cầu như sau: “Thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm phải được liệt kê trước c ng tên đầy đủ và hàm lượng Các thành phần khác được liệt kê tiếp sau theo thứ tự giảm dần về khối lượng” Điều này cho thấy, văn bản không quy định bắt buộc hàm lượng bổ sung phải là bao nhiêu, tuy nhiên, cá nhân, tổ chức cần phải đảm bảo về khuyến cáo đối với sức khỏe người d ng nếu có [51].
- Căn cứ khoa học: Tham khảo một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có
thành phần mật nhân được bán trên thị trường, cụ thể: Trong hướng dẫn sử dụng sâm Alipas thì một ngày có thể sử dụng từ 1 đến 2 viên sâm Alipas, mỗi viên chứa 240 mg tinh chất mật nhân QPA mật nhân chứa 400 mg mật nhân mỗi viên được khuyên d ng từ 1 đến 2 viên mỗi ngày Thông tin hướng dẫn sử dụng của Hadariki Tongkat Ali cũng cho biết rằng liều lượng sử dụng một ngày là từ 1 đến 2 viên sâm Alipas, mỗi viên chứa 500 mg tinh chất mật Như vậy, với kết quả các nghiên cứu trước đây đối với loại sản phẩm này, liều d ng cao chiết từ mật nhân cho ph p dao động từ 240 đến 1000 mg/ngày đối với một người bình thường Bên cạnh đó, dịch chiết mật nhân đã được thử nghiệm độc tính bất thường và khả năng gây độc tế bào người với kết quả đạt yêu cầu, do đó, việc bổ sung một lượng cao chiết mật nhân hoặc bột mật nhân với liều lượng không quá 1000 mg trong một đơn vị sản phẩm vào quy trình sản xuất thực phẩm sẽ không gây nguy hại cho sức khỏe con người [77] [80].
2.4.5.2. Nghiên cứu sản xuất cao chiết mật nhân
- Sản xuất cao chiết mật nhân từ dung môi nước để sử dụng trực tiếp như một
loại cao dược liệu Các chỉ tiêu chất lượng của cao chiết được thử nghiệm để đối sánh với theo yêu cầu kỹ thuật trong dược điển Việt Nam hiện hànhvà các chỉ tiêu đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm
- Sử dụng cao chiết để bổ sung vào quy trình sản xuất trà thảo mộc mật nhân
2.4.5.3. Nghiên cứu sản xuất bột mật nhân
- Sản xuất bột mật nhân từ dịch chiết ethanol 80 % để bổ sung vào quy trình sản
xuất nước rau má mật nhân.
2.4.5.4. Nghiên cứu sản xuất trà thảo mộc mật nhân và nước rau má mật nhân
rau má mật nhân. Hai sản phẩm này định hướng dưới dạng thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Quá trình nghiên cứu, sản xuất và công bố chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có bổ sung mật nhân phải tuân thủ quy định theo Thông tư 43/2014/TT- BYT quy định về quản lý thực phẩm chức năng và đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm theo quy định của Nghị định 15/2018/NĐ-CP, các bước cơ bản được thực hiện bao gồm: a. Tham khảo một số quy trình sản xuất thực phẩm đã được nghiên cứu và công bố. b. Nghiên cứu bổ sung cao chiết mật nhân/ bột mật nhân: Hàm lượng bổ sung được xác định dựa trên các nghiên cứu trước đây đã ứng dụng trong các sản phẩm có bổ sung chiết xuất rễ mật nhân được bán trên thị trường.
c. Thực nghiệm sản xuất sản xuất trà thảo mộc mật nhân và nước rau má mật nhân.
- Nguyên liệu sản xuất trà thảo mộc mật nhân: Nụ vối, cỏ ngọt, cam thảo, la hán quả, cao chiết mật nhân: Sử dụng cao chiết được trình bày ở mục 2 4 5 2 để bổ sung vào quy trình sản xuất
- Công thức thử nghiệm sản xuất 1 lít trà thảo mộc mật nhân: Nụ vối khô: 30 g; quả la hán khô: 6 g; cỏ ngọt khô: 8,5 g; cam thảo: 1 g; nước: 1400 mL; cao chiết mật nhân.
- Nguyên liệu sản xuất nước rau má mật nhân: Rau má, bột mật nhân: Sử dụng bột mật nhân được trình bày ở mục 2 4 5.3 để bổ sung vào quy trình sản xuất
- Khảo sát tỷ lệ bổ sung chất trợ lắng: Trong quá trình thực hành sản xuất, nhận thấy nước rau má mật nhân là một hệ huyền ph với pha liên tục là nước và các chất hòa tan, còn pha phân tán là các phân tử thịt rau, do đó, khi bảo quản nước rau má trong thời gian dài dễ dẫn đến hiện tượng nước rau má bị phân lớp Vì vậy, cần nghiên cứu bổ sung chất phụ gia để ổn định cấu trúc của sản phẩm trong quá trình sản xuất nước rau má mật nhân
- Công thức thử nghiệm sản xuất 1 lít nước rau má mật nhân: Rau má: 265 g; nước: 795 mL; đường: 8 % ứng với 80 g; bột mật nhân; chất trợ lắng; NaHCO3 dùng để chỉnh pH
d. Kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm
- Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng: AOAC 999 11
1:2015), Colifoms (TCVN 6848:2007), Escherichia coli (TCVN 7924-2:2008 , tổng số bào tử nấm men và nấm mốc TCVN 8275-1:2010).
Các thí nghiệm này được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng.
e. Đánh giá cảm quan sản phẩm
Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để đánh giá mức độ chấp nhận của người tiêu d ng đối với sản phẩm dựa theo phương pháp đánh giá của Nguyễn Hoàng Dũng và các cộng sự biên dịch năm 2007 [88].
Nguyên tắc: Người thử được mời nếm thử sản phẩm, sau đó sẽ cho biết mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với từng sản phẩm bằng thang điểm đã được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả mức độ hài lòng Trong nghiên cứu này sử dụng thang thị hiếu 9 điểm được sắp xếp theo cấp độ tăng dần như sau:
1 - cực kì thích 6 - tương đối thích
2 - rất không thích 7 - thích
3 - không thích 8 - rất thích
4 - tương đối không thích 9 - cực kì thích 5 - không thích cũng không gh t
Tổ chức thí nghiệm
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm cảm quan của trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng
- Người thử: Sinh viên trường đại học bách khoa Đà Nẵng, là những người không qua huấn luyện
- Số lượng người thử: 60 người không lặp lại
Chuẩn bị và trình bày thí nghiệm
- Chuẩn bị dụng cụ: Thìa, ch n, nước thanh vị, giấy, bút
- Thiết kế phiếu chuẩn bị thí nghiệm cảm quan, phiếu hướng dẫn và phiếu trả lời
Cách tiến hành
- Mỗi người tham gia thử sẽ nhận được phiếu hướng dẫn và phiếu trả lời, lần lượt thử và cho biết kết quả đánh giá vào phiếu trả lời
Các thí nghiệm cảm quan được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng.
- Các số liệu thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết được xử l bằng các phần mềm Matlab R2016a và Excel
- Các số liệu thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học được xử l bằng các phần mềm TableCurve 2Dv4 và Excel.
- Các số liệu thí nghiệm cảm quan được xử l bằng các phần mềm Excel g. Công bố chất lượng sản phẩm
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Định danh mẫu thực vật và lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu
3.1.1. Kết quả định danh mẫu thực vật
Cây mật nhân được thu nhận tại v ng đồi núi huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai và huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, mẫu thực vật được định danh tại Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam với kết quả:
- Tên khoa học: Eurycoma longifolia jack
- Họ: Simaroubaceae
- Tên Việt Nam: Bách bệnh, bá bịnh, lồng bẹt, mật nhân, tho nan Tày , mờ lụ
(Kho).
- Phân bố: Ở Việt Nam, cây mật nhân mọc phổ biến tại các tỉnh Quảng Ninh,
Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, TP Hồ Chí Minh, Kiên Giang. Trên thế giới, khá phổ biến ở Ấn Độ, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippine.
Kết quả chi tiết được trình bày tại phụ lục 4.
3.1.2. Đánh giá, lựa chọn vùng nguyên liệu nghiên cứu
Đối với một nghiên cứu về một loại thảo dược, lựa chọn nguồn nguyên liệu rất quan trọng, mục đích vừa đảm bảo khai thác đúng loại dược liệu cần nghiên cứu, vừa đảm bảo chất lượng, sản lượng ổn định và đủ cho quá trình nghiên cứu lâu dài Do đó, ngoài việc định danh mẫu thực vật, chúng tôi cần thực hiện một số thực nghiệm để xác định nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu.
Chúng tôi thu nhận một số mẫu rễ cây mật nhân tại hai địa điểm: Vùng núi huyện Ia Grai – Gia Lai và huyện Phước Sơn – Quảng Nam. Thực hiện phân tích một số thành phần hóa học trong rễ mật nhân và thăm dò một số hoạt tính sinh học trên các đối tượng dịch chiết từ nguyên liệu của vùng này. Từ kết quả phân tích thu được, kết hợp với quan sát thực tế, chúng tôi lựa chọn địa điểm thu hái nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu.
Theo quan sát thực tế của chúng tôi trong quá trình nghiên cứu nguyên liệu, tại khu vực miền Trung - Tây Nguyên, v ng núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam là những nơi có cây mật nhân mọc tự nhiên rất nhiều, đặc biệt là ở v ng đồi núi của một số huyện thuộc tỉnh Gia Lai, mật nhân rất phong phú và được khai thác, bày bán ngoài thị trường phổ biến hơn các địa phương khác
3.1.2.1. Khảo sát một số thành phần cơ bản của nguyên liệu
Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý trong hai loại nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Phân tích một số thành phần hóa học trong rễ mật nhân tại Gia Lai và Quảng Nam
Chỉ tiêu ĐVT Quảng Nam Gia Lai
Protein % 3,53 5,94 Tro tổng % 0,02 0,03 Xenlulose % 32 44 Lipid % 4,13 4,53 Zn mg/kg 5,48 6,10 Cu mg/kg 1,60 4,29
Pb mg/kg Không phát hiện <0,05 Không phát hiện <0,05 Hg mg/kg Không phát hiện <0,005 Không phát hiện <0,005 Cd mg/kg Không phát hiện <0,05 Không phát hiện <0,05
Nhận xét: Kết quả phân tích ở bảng 3.1 cho thấy, một số thành phần cơ bản trong nguyên liệu rễ cây mật nhân ở vùng núi Quảng Nam và Gia Lai tương đối giống nhau và về mặt dinh dưỡng, chúng đều có giá trị tương đương như thành phần của một số loại rau củ thông dụng đối với con người.
3.1.2.2. Khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư
Kết quả khảo sát (sàng lọc) khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro đối với dịch chiết ethanol 80 % của hai loại nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3.
Kết quả chi tiết được trình bày tại phụ lục 4.
Bảng 3.2. Khả năng gây độc tế bào ung thƣcủa dịch chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân tại huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai
% ức chế tế bào Nồng độ
(µg/mL) LU-1 LNCaP MCF7 Hep-G2
100 91,66 86,35 100,49 94,17 20 16,81 23,68 10,62 15,38 4 3,83 14,43 2,92 8,91 0,8 -1,65 -9,75 -4,32 -6,23 IC50 55,20±6,4 44,36±4,17 58,56±4,92 53,69±5,63 Nồng độ (µg/mL) Ellipticine
LU-1 LNCaP MCF7 Hep-G2
Bảng 3.3. Khả năng gây độc tế bào ung thƣcủa dịch chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân tại huyện Phƣớc Sơn, tỉnh Quảng Nam
% ức chế tế bào Nồng độ
(µg/mL) LU-1 LNCaP MCF7 Hep-G2
100 64,52 66,79 68,27 71,84 20 21,26 25,09 27,72 30,37 4 12,86 19,81 16,29 15,16 0,8 9,55 11,13 13,09 8,38 IC50 72,35±7,16 64,69±7,05 60,86±2,40 51,50±3,41 Nồng độ (µg/mL) Ellipticine
LU-1 LNCaP MCF7 Hep-G2
IC50 0,42±0,06 0,36±0,05 0,39±0,02 0,38±0,02
Nhận xét: Từ kết quả của bảng 3.2 và 3.3 nêu trên cho thấy, dịch chiết ethanol 80 % của rễ cây mật nhân của cả hai vùng nguyên liệu đều có khả năng gây độc tế bào ung thư với các dòng đã khảo sát, tuy nhiên, một số giá trị IC50 trong bảng 3.2 nhỏ hơn trong bảng 3.3, có nghĩa là, khảnăng kháng độc tế bào ung thư trên một số dòng tế bào của dịch chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân tại huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai có tốt hơn so với dịch chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân tại huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam.
3.1.2.3. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thông qua khả năng dập
tắt gốc tự do DPPH
Khả năng kháng oxy hóa được đánh giá thông qua khả năng dập tắt gốc tự do DPPH DPPH radical scavenging activity , điều này thể hiện qua sự thay đổi màu của dung dịch DPPH sau khi bổ sung dịch chiết rễ mât nhân ở những nồng độ khác nhau (50 µg/mL; 25 µg/mL; 12,5 µg/mL; 6,25 µg/mL; 3,125 µg/mL trên 2 mẫu: Mẫu 1 là mẫu đối chứng vitamin C, mẫu 2 là dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai, mẫu 3 là dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam, kết quả thể hiện qua hình 3.1.
Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C và hai mẫu dịch chiết được trình bày ở hình 3.2 và đường xu hướng của khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam
Hình 3.3. Đƣờng xu hƣớng của khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam.
Kết quả thể hiện ở hình 3.2 và hình 3.3 cho thấy, khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch chiết rễ mật nhân và vitamin C tăng theo sự tăng nồng độ. Trong khoảng nồng độ thấp (0 - 15 μg/mL), khi tăng nồng độ dịch chiết rễ mật nhân thì khả năng bắt gốc tự do DPPH tăng mạnh, nếu tiếp tục tăng nồng độ rễ mật nhân thì khả năng bắt
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 %D P P H Nồng độ µg/ml
VITAMIN C GIA LAI QN
y = 54.451x + 8.4644 R² = 0.966 y = 17.043x - 0.0067 R² = 0.9739 y = 16.411x + 1.4595 R² = 0.9698 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 %D P P H Log nồng độ
gốc tự do DPPH tăng nhẹ.
Từ đồ thị ở hình 3.3, tính toán giá trị IC50 của mẫu dịch chiết và vitamin C (IC50 là nồng độ phần trăm khi chất đó thể hiện hoạt tính kháng 50 %), kết quả được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Giá trị IC50 của dịch chiết rễ mật nhân và vitamin C
Tên mẫu IC50 (µg/mL)
Dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam 907,4082
Dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai 859,3081
Vitamin C 5,791712
Nhận xét: Từ kết quả của bảng 3.4 cho thấy, dịch chiết rễ cây mật nhân ở cả hai