6. Bố cục của luận án
2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu
Rễ cây mật nhân Phân lập, xác định thành phần, cấu trúc hóa học Trà thảo mộc mật nhân Nước rau má mật nhân Chiết phân đoạn
Tinh chế, làm sạch
Định danh, xác định cấu trúc
Sản xuất cao chiết mật nhân
Thăm dò hoạt tính sinh học:
Kháng tế bào ung thư, kháng
viêm, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng sinh
Thử độc tính bất thường, độc tính
với tế bào người
Bổ sung cao mật nhân Đánh giá cảm quan
Đánh giá ATVSTP
Xây dựng quy trình chiết:
Lựa chọn phương pháp chiết
và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết
Tối ưu hóa một số yếu tố
ảnh hưởng quy trình chiết trong dung môi nước và ethanol 80 % Dịch chiết nước Dịch chiết ethanol 80 % Đánh giá ATVSTP Đánh giá cảm quan Đánh giá ATVSTP Bổ sung bột mật nhân Sản xuất bột mật nhân Khảo sát, lựa chọn nguyên
liệu nghiên cứu
Công bố chất lượng
Công bố chất lượng
Rễ cây mật nhân được thu nhận từ vùng núi huyện Ia Grai - tỉnh Gia Lai và vùng núi huyện Phước Sơn - tỉnh Quảng Nam, nguyên liệu được khảo sát, đánh giá, lựa chọn nhằm sử dụng cho toàn bộ quá trình nghiên cứu. Rễ cây mật nhân được xử lý sơ bộ, xay nhỏ thành bột, sau đó, chiết trong các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau tạo thành dịch chiết để phân lập và định danh, xác định thành phần hóa học, cấu trúc hóa học của các hợp chất. Từ kết quả đó, chúng tôi nghiên cứu chọn hàm mục tiêu để tối ưu hóa các thông số nhằm xây dựng quy trình chiết. Ngoài ra, chúng tôi khảo sát hoạt tính sinh học các dịch chiết thu được để làm cơ sở cho quá trình ứng dụng bổ sung trong quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng ở mô phòng thí nghiệm, đánh giá chất lượng và an toàn thực phẩm của các sản phẩm thu được. Sản xuất cao chiết mật nhân và bột mật nhân để bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đánh giá cảm quan, an toàn thực phẩm, thời gian bảo quản và công bố chất lượng sản phẩm.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm
2.4.1. Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu
Các tiêu chí được sử dụng để đánh giá, lựa chọn nguyên liệu bao gồm:
- Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học và các chỉ tiêu hóa l được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng với các phương pháp phân tích sau:
Phương pháp lấy mẫu thực vật: TCVN 8551:2010
Phương pháp xác định hàm lượng protein: TCVN 8125:2015 Phương pháp xác định hàm lượng lipit: TCVN 6555:2017 Phương pháp xác định hàm lượng xơ thô: TCVN 5103:1990 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng: KT2 K2 TN-15/TP Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng: AOAC 999 11 - Sàng lọc một số hoạt tính sinh học của dịch chiết như:
Thử khả năng kháng độc tế bào ung thư: Sử dụng phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp [29]. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện sinh học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
Thử khả năng kháng oxy hóa: Sử dụng phương pháp đánh giá thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết vì
điều kiện thực hiện thuận lợi và gần đây có nhiều tác giả đã chọn phương pháp này [35]. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng.
Từ kết quả nghiên cứu và sàng lọc, vùng nguyên liệu được lựa chọn để thu nhận rễ mật nhân nhằm thực hiện các công đoạn nghiên cứu tiếp theo.
2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân mật nhân
2.4.2.1. Phân lập các hợp chất hóa học
a. Nhóm hợp chất alkaloid
Hình 2.3. Sơ đồ chƣng cất tạo cao chiết nƣớc
Rễ mật nhân
Chưng ninh hồi lưu
Lọc
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0
C, số vòng quay: 40 vòng/phút
Cao chiết nước Nước + Nhiệt độ: 70 oC + Thời gian: 120 phút + Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20 mL/1 g Bã
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất nhóm alkaloid
Tiến hành chưng ninh hồi lưu trong nước 4 kg bột rễ cây mật nhân ở nhiệt độ 70 oC trong 120 phút với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20 mL/g theo sơ đồ hình 2.3. Sau khi loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô quay chân không thu được 40 g cặn chiết nước. Cho 40 g cặn chiết nước qua hệ thống sắc ký cột với chất hấp phụ là Diaion đường kính cột d = 60 mm; chiều dài lớp Diaion l = 800 mm); hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2); MeOH:H2O (5:5) và MeOH 100 %, thu được 15 nhóm phân đoạn chính, ký hiệu từ F1 đến F15.
SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải 100%
H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2);
MeOH:H2O (5:5) và MeOH 100%thu được
15 phân đoạn F1-F15)
Cao chiết nước (40 g)
F8 (1,7 g) (F8 + F9)
SKC silicagel, hệ dung
môi CH2Cl2:MeOH
98:2 tăng dần đến 1:1), thu được 19 phân đoạn
F3 (17 g) (F3 + F7)
SKC silicagel, hệ dung
môi CH2Cl2:MeOH
95:5 tăng dần đến tỷ lệ 1:1 , thu được 14 phân đoạn EL1B (10 mg) (trắng) EL1C (5 mg) (trắng) F8.12.1 ...F8.12.7 chọn F8.12.3 F3.1 ... F3.15 chọn F3.2 (1,2 g)
SKC silicagel, hệ dung môi
CH2Cl2:MeOH 9:1tăng dần
đến 1:1), rửa giải bằng hệ
dung môi MeOH:H2O (1:1),
thu được 15 nhóm phân đoạn
SKC Sephadex (2 lần) F3.2.1 ...F3.2.14 chọn F3.2.12 EL4 (6 mg) (vàng) F3.1 ...F3.15 chọn F3.6 (0,12 g) SKC Sephadex (2 lần) F3.6.1 ... F3.6.4 chọn F3.6.2 SKC silicagel, hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 , thu được 4 phân đoạn EL5 (6 mg) (trắng) F8.1 ...F8.19 chọn F8.12 (200 mg) SKC Sephadex, rửa giải bằng MeOH, thu được 7 phân đoạn
SKC Sephadex
Phân đoạn F8 và F9 được gộp lại ký hiệu F8 (1,7 g được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043 mm - 0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 98:2 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 19 phân đoạn, được ký hiệu là F8 1 đến F8 19 Phân đoạn F8 12 200 mg được tách qua sắc ký cột sephadex rửa giải bằng MeOH thu được 7 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F8.12.1 đến F8 12 7 Phân đoạn F8.12.3 sau hai lần được tách bằng sắc ký cột sephadex thu được 10 mg chất sạch rắn, màu trắng k hiệu là EL1B (chất 1) và 5 mg chất rắn màu trắng EL1C (chất 4).
Phân đoạn F3 và F7 được gộp lại ký hiệu F3 17 g và được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 9:1 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1 và cuối cùng rửa giải cột bằng hệ dung môi MeOH:H2O 1:1 , thu được 15 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F3.1 đến F3. 15.
Phân đoạn F3.2 (1.2 g được tách bằng sắc ký cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 95:5 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ F 3 2 1 đến F3.2.14.
Phân đoạn F3.2.12 (20 mg) sau hai lần qua cột Sephadex thu được 6 mg chất sạch dạng rắn màu vàng ký hiệu EL4 (chất 2). Phân đoạn F3.6 (0,12 g) tách bằng sắc ký cột silicagel hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 thu được 4 phân đoạn Phân đoạn F3.6.2 được tách bằng sắc k thu được 4 mg chất sạch màu trắng ký hiệu EL5 (chất 3).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết nước của rễ cây mật nhân được mô tả ở hình 2.3 và hình 2.4 [5].
b. Nhóm hợp chất khác
Hình 2.5. Sơ đồ tạo cao chiết n-henxane và cao chiết ethyl acetate
Rễ mật nhân
Chiết Soxhlet trong 24 giờ
Lọc
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0
C, số vòng quay: 40
Cao chiết n-hexane n-
hexane
Ngâm chiết với ethanol 85 % trong 3 giờ
Chiết trong ethyl acetate
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0
C, số vòng quay: 40
Cao chiết ethyl acetate Bả
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các chất không thuộc nhóm alkaloid
Tiến hành chiết Soxhlet trong n-hexane 3 kg bột rễ cây mật nhân trong 7 lít dung môi trong 24 giờ, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4,1 g cặn. Phần bã được ngâm chiết với ethanol 85 % 3 kg bã được chiết trong 8 lít dung môi trong 3 giờ), khuấy ở nhiệt độ 50 oC và tiếp tục để ngâm qua đêm Sau ba lần chiết, dịch chiết được lọc và quay cất dưới áp suất giảm đến thể tích khoảng 500 mL. Cho ethyl acetate vào, chiết phân lớp ba lần (mỗi lần 250 mL). Dịch chiết ethyl acetate được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 69,1 g cặn chiết ethyl acetate.
Cao chiết n-hexane 4,1 g được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn. Ở phân đoạn 6 thu được 6 mg một chất sạch màu vàng hình kim kết tinh được ký hiệu là MNH1 (chất 5).
Cao chiết ethyl acetate 35 g được phân tách bằng cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 1 đến PĐE 92 Phân đoạn PĐE 25 có 20 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết
SKC silica gel, hệ dung môi
rửa giải CH2Cl2/MeOH
9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn PĐH1- PĐH10
Cao chiết n-hexane (4,1 g)
PĐH 1…PĐH 10 chọn PĐH6 PĐE 34 550 mg MNH1 (6 mg) (vàng) MN.25.10 (20 mg) (trắng) PĐE 34 1 PĐE 34 5 chọn PĐE 34 2 1,2 g
SKC, dung môi rửa
giải là MeOH/H2O
1/1 thu được 5 phân đoạn PĐE 34 1- PĐE 34 5
MN.34.2 (6 mg) (trắng) SKC silica gel, hệ dung môi
rửa giải CH2Cl2/MeOH
9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn PĐE 1- PĐE 92
Cao chiết ethyl acetate (35 g)
tinh được đặt tên là MN.25.10 (chất 6 Phân đoạn PĐE 34 550 mg được chạy cột Rp với hệ dung môi rửa giải là MeOH:H2O (1:1) thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 34 1 đến PĐE 34 5 Phân đoạn PĐE 34 2 có 25 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết tinh được đặt tên là MN.34.2 (chất 7).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết n-hexane và cao chiết ethyl acetate của rễ cây mật nhân được mô tả ở hình 2.5 và hình 2.6 [7].
2.4.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được
Cấu trúc hóa học của các chất sạch được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý (tonc, []D và các phương pháp phổ hiện đại như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI- MS), phổ khối có độ phân giải cao (HR-ESI-MS , phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) [27] [28].
2.4.3. Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân
Rễ cây mật nhân được ứng dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm dưới dạng cao chiết hoặc bột được chiết xuất từ nước và cồn thực phẩm. Vì vậy, dung môi được chúng tôi lựa chọn để thu nhận sản phẩm cao chiết từ rễ mật nhân là nước và ethanol 80 % Phương pháp chiết được chọn là phương pháp chưng ninh hồi lưu với nhiều lợi thế và hiệu quả như đã trình bày trong phần tổng quan.
- Mô hình tiến hành thí nghiệm:
Hình 2.7. Hệ thống chƣng ninh hồi lƣu
Hệ thống chưng ninh hồi lưu: Bao gồm một bình cầu nối với ống sinh hàn và được đặt trên bể điều nhiệt. Ống sinh hàn với dòng nước lạnh chảy qua liên tục nên khi dung môi bay hơi lên sẽ bị ngưng tụ trở lại bình do tránh sự tổn thất của cấu tử bị cuốn
theo dung môi bay hơi dưới tác dụng nhiệt và tiết kiệm lượng dung môi. Quy trình chiết tổng quát được trình bày trên hình 2 8
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình chiết
Bột rễ mật nhân được chưng ninh ở điều kiện nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu xác định, sau đó, tiến hành lọc chân không thu được dich chiết Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút). Phân tích đại lượng đầu ra đối với dịch chiết nước: Hàm lượng EL4 cao nhất, đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết từ khối lượng cao khô trước và sau quá trình chiết
Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình chiết rễ mật nhân được trình bày tại phụ lục 2
2.4.3.1. Chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %
Quy trình chiết rễ mật nhân trong dung môi ethanol 80 % dựa trên việc tham khảo và kế thừa các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả C K Foong và cộng sự vào năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh, Mai Hưng Trấn vào năm 2017 [74] [84]. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết được tối ưu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố 2 mức, các mức yếu tố được lựa chọn lần lượt:
Rễ mật nhân
Chưng ninh hồi lưu
Lọc
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút
Đo đại lượng đầu ra đối với dịch chiết: Hàm lượng EL4, đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết Dung
môi
Khảo sát các yếu tố: + Nhiệt độ chiết + Thời gian chiết + Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu Bã
- X1: Nhiệt độ chiết 60 oC đến 80 o C;
- X2: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1 mL/g đến 40/1 mL/g; - X3: Thời gian chiết 2 giờ đến 4 giờ;
- Hàm mục tiêu Y: Hiệu suất chiết cao nhất, trong đó, hiệu suất chiết được xác định bằng phương pháp cô quay chân không dung dịch lọc sau chưng ninh hồi lưu, sấy đến khối lượng cặn không đổi Hiệu suất chiết H, % là tỷ lệ phần trăm giữa khối lượng cao khô mật nhân thu được sau khi sấy khô m2, g với khối lượng mẫu thí nghiệm ban đầu (m1, g).
Các bước thực hiện quy hoạch thực nghiệm [85]:
Bước 1: Xác định một điểm xuất phát nằm trong miền giới hạn tổng thể của các biến đầu vào. Chọn điểm đó làm mức cơ bản. Chọn khoảng biến thiên của từng biến để xác định miền giới hạn của quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1.
Bước 2: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch trực giao cấp 1. Xây dựng phương trình hồi quy bậc nhất: Nếu phương trình hồi quy bậc nhất không tương thích thì chuyển đến thực hiện bước 4. Nếu phương trình hồi quy bậc nhất tương thích thì thực hiện bước 3.
Bước 3: Xác định vectơ gradient của hàm mục tiêu tại mức cơ bản và xuất phát từ mức cơ bản xác định tọa độ các điểm thực nghiệm nằm cách đều nhau trên hướng của vectơ gradient với khoảng cách tự chọn phù hợp với đối tượng nghiên cứu. Làm thực nghiệm để xác định một điểm có giá trị hàm mục tiêu tốt nhất trên hướng gradient. Chọn điểm tìm được làm điểm xuất phát mới và quay về bước 2.
Bước 4: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch cấp 2 trực giao hoặc là tâm quay.
Bước 5: Xây dựng phương trình hồi quy bậc hai:
Nếu phương trình hồi quy bậc 2 không tương thích thì chuyển tới thực hiện bước 6.
Nếu phương trình hồi quy bậc hai tương thích thì thực hiện bước 7.
Bước 6: Thu hẹp khoảng biến thiên của các biến đầu vào rồi quay về bước 5.
Bước 7: Tìm cực trị của hàm mục tiêu thu được ở dạng phương trình hồi quy bậc 2 thu được ở bước 5 và thực nghiệm lại để kiểm chứng và đánh giá kết quả.
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm trên, lập các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm
Các mức Các yếu tố ảnh hƣởng Nhiệt độ X1 (oC) Tỷ lệ dung môi và