6. Bố cục của luận án
2.4.3. Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân
Rễ cây mật nhân được ứng dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm dưới dạng cao chiết hoặc bột được chiết xuất từ nước và cồn thực phẩm. Vì vậy, dung môi được chúng tôi lựa chọn để thu nhận sản phẩm cao chiết từ rễ mật nhân là nước và ethanol 80 % Phương pháp chiết được chọn là phương pháp chưng ninh hồi lưu với nhiều lợi thế và hiệu quả như đã trình bày trong phần tổng quan.
- Mô hình tiến hành thí nghiệm:
Hình 2.7. Hệ thống chƣng ninh hồi lƣu
Hệ thống chưng ninh hồi lưu: Bao gồm một bình cầu nối với ống sinh hàn và được đặt trên bể điều nhiệt. Ống sinh hàn với dòng nước lạnh chảy qua liên tục nên khi dung môi bay hơi lên sẽ bị ngưng tụ trở lại bình do tránh sự tổn thất của cấu tử bị cuốn
theo dung môi bay hơi dưới tác dụng nhiệt và tiết kiệm lượng dung môi. Quy trình chiết tổng quát được trình bày trên hình 2 8
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình chiết
Bột rễ mật nhân được chưng ninh ở điều kiện nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu xác định, sau đó, tiến hành lọc chân không thu được dich chiết Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút). Phân tích đại lượng đầu ra đối với dịch chiết nước: Hàm lượng EL4 cao nhất, đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết từ khối lượng cao khô trước và sau quá trình chiết
Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình chiết rễ mật nhân được trình bày tại phụ lục 2
2.4.3.1. Chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %
Quy trình chiết rễ mật nhân trong dung môi ethanol 80 % dựa trên việc tham khảo và kế thừa các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả C K Foong và cộng sự vào năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh, Mai Hưng Trấn vào năm 2017 [74] [84]. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết được tối ưu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố 2 mức, các mức yếu tố được lựa chọn lần lượt:
Rễ mật nhân
Chưng ninh hồi lưu
Lọc
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút
Đo đại lượng đầu ra đối với dịch chiết: Hàm lượng EL4, đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết Dung
môi
Khảo sát các yếu tố: + Nhiệt độ chiết + Thời gian chiết + Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu Bã
- X1: Nhiệt độ chiết 60 oC đến 80 o C;
- X2: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1 mL/g đến 40/1 mL/g; - X3: Thời gian chiết 2 giờ đến 4 giờ;
- Hàm mục tiêu Y: Hiệu suất chiết cao nhất, trong đó, hiệu suất chiết được xác định bằng phương pháp cô quay chân không dung dịch lọc sau chưng ninh hồi lưu, sấy đến khối lượng cặn không đổi Hiệu suất chiết H, % là tỷ lệ phần trăm giữa khối lượng cao khô mật nhân thu được sau khi sấy khô m2, g với khối lượng mẫu thí nghiệm ban đầu (m1, g).
Các bước thực hiện quy hoạch thực nghiệm [85]:
Bước 1: Xác định một điểm xuất phát nằm trong miền giới hạn tổng thể của các biến đầu vào. Chọn điểm đó làm mức cơ bản. Chọn khoảng biến thiên của từng biến để xác định miền giới hạn của quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1.
Bước 2: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch trực giao cấp 1. Xây dựng phương trình hồi quy bậc nhất: Nếu phương trình hồi quy bậc nhất không tương thích thì chuyển đến thực hiện bước 4. Nếu phương trình hồi quy bậc nhất tương thích thì thực hiện bước 3.
Bước 3: Xác định vectơ gradient của hàm mục tiêu tại mức cơ bản và xuất phát từ mức cơ bản xác định tọa độ các điểm thực nghiệm nằm cách đều nhau trên hướng của vectơ gradient với khoảng cách tự chọn phù hợp với đối tượng nghiên cứu. Làm thực nghiệm để xác định một điểm có giá trị hàm mục tiêu tốt nhất trên hướng gradient. Chọn điểm tìm được làm điểm xuất phát mới và quay về bước 2.
Bước 4: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch cấp 2 trực giao hoặc là tâm quay.
Bước 5: Xây dựng phương trình hồi quy bậc hai:
Nếu phương trình hồi quy bậc 2 không tương thích thì chuyển tới thực hiện bước 6.
Nếu phương trình hồi quy bậc hai tương thích thì thực hiện bước 7.
Bước 6: Thu hẹp khoảng biến thiên của các biến đầu vào rồi quay về bước 5.
Bước 7: Tìm cực trị của hàm mục tiêu thu được ở dạng phương trình hồi quy bậc 2 thu được ở bước 5 và thực nghiệm lại để kiểm chứng và đánh giá kết quả.
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm trên, lập các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm
Các mức Các yếu tố ảnh hƣởng Nhiệt độ X1 (oC) Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu X2 (mL/g) Thời gian X3 (giờ) Mức dưới 60 20/1 2 Mức cơ sở 70 30/1 3 Mức trên 80 40/1 4
Khoảng biến thiên 10 10/1 1
Chọn phương án quy hoạch trực giao cấp 1 (TYT2k) thực nghiệm yếu tố toàn phần 2 mức, k = 3 yếu tố ảnh hưởng Phương trình hồi quy có dạng:
Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+ b12x1x2 + b23x2x3+ b13x1x3+b123x1x2x3 (2.1) [85] Trong đó: - x1: Nhiệt độ chiết (oC);
- x2: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g). - x3: Thời gian chiết (giờ);
Với 3 yếu tố tối ưu k = 3 , số thí nghiệm phải thực hiện là N = 2k = 23 = 8 [85] thí nghiệm của quy hoạch trực giao cấp 1 và 3 thí nghiệm tại tâm phương án Tổ chức thí nghiệm và thu được kết quả thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Ma trận và kết quả thí nghiệm
TN
Yếu tố thí nghiệm trong hệ
tọa độ không thứ nguyên Yếu tố thí nghiệm Y (%) x0 x1 x2 x3 X1 (oC) X2 (mL/g) X3 (giờ) 1 + + + + 80 40/1 4 6,916 2 + - + + 60 40/1 4 5,566 3 + + - + 80 20/1 4 6,888 4 + - - + 60 20/1 4 5,702 5 + + + - 80 40/1 2 6,368 6 + - + - 60 40/1 2 5,602 7 + + - - 80 20/1 2 6,466 8 + - - - 60 20/1 2 5,442 T1 + 0 0 0 70 30/1 3 6,476 T2 + 0 0 0 70 30/1 3 6,476 T3 + 0 0 0 70 30/1 3 6,610 Trong đó:
+ T1, T2, T3 là thí nghiệm tại tâm phương án; + X1, X2, X3 là các thông số tối ưu;
+ x1, x2, x3 là các biến mã không thứ nguyên tương ứng với X1, X2, X3
2.4.3.2. Chiết rễ mật nhân trong dung môi nước
a. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bao gồm: Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu. Các số liệu chọn để bố trí các thí nghiệm được kế thừa từ các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả C K Foong và cộng sự vào năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh, Mai Hưng Trấn vào năm 2017 [74] [84].
Cách bố trí thí nghiệm được tình bày cụ thể sau:
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết rễ mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thông số được trình bày ở bảng 2 3.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố nhiệt độ
Số thứ tự mẫu 1 2 3 4
Nhiệt độ chiết (oC) 70 80 90 100
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g) 20/1
Thời gian chiết (phút) 120
Hàm lượng EL4 (mg/kg) Y1 Y2 Y3 Y4
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến quá trình chiết mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thông số được trình bày ở bảng 2 4.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Số thứ tự mẫu 5 6 7 8
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g) 10/1 20/1 30/1 40/1
Thời gian chiết (phút) 120
Nhiệt độ chiết (oC) Đã khảo sát tại thí nghiệm 1
Hàm lượng EL4 (mg/kg) Y5 Y6 Y7 Y8
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình chiết mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thông số được trình bày ở bảng 2 5.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian chiết
Số thứ tự mẫu 9 10 11 12
Thời gian chiết (phút) 60 90 120 150
Nhiệt độ chiết (oC) Đã khảo sát tại thí nghiệm 1 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (mL/g) Đã tối khảo sát thí nghiệm 2
Hàm lượng EL4 (mg/kg) Y9 Y10 Y11 Y12
Hàm mục tiêu Y: Hàm lượng chất EL4 cao nhất Định lượng chất EL4 có trong mẫu bằng hệ thống HPLC dựa trên nguyên tắc: Xác định diện tích pic trên sắc k đồ tại thời điểm mà thời gian lưu của mẫu trùng với thời gian lưu của chất chuẩn EL4. Sau đó từ đường chuẩn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic suy ra hàm lượng chất EL4 [23].
Điều kiện sắc ký:
- Pha động: MeOH : H2O = 70 % : 30 %
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút - Thể tích mẫu tiêm: 5 µL
- Detector Diode Array DAD, bước sóng: 254 nm - Cột C8-250 mm, Post column system.
b. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng
Trên cơ sở kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố, chúng tôi thực hiện tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước.
Chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với 2 yếu tố ảnh hưởng Phương trình hồi quy có dạng:
Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 (2.2) [85]. Trong đó: - x1: thời gian chiết (giờ);
- x2: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g). Hàm mục tiêu: Hàm lượng EL4 (mg/kg) lớn nhất.
Với 2 yếu tố tối ưu k = 2 , số thí nghiệm phải thực hiện là N = 2k = 22 = 4 thí nghiệm của quy hoạch trực giao cấp 1 và 3 thí nghiệm tại tâm phương án
nghiệm trực giao cấp 1 - yếu tố toàn phần với 2 yếu tố ảnh hưởng TYT22 , được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Ma trận và kết quả thí nghiệm
Thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm trong hệ
tọa độ không thứ nguyên Yếu tố thí nghiệm Y (mg/kg) x0 x1 x2 X1 (giờ) X2 (mL/g) 1 + + + 3 40/1 14,4 2 + - + 1 40/1 13,2 3 + + - 3 20/1 14,1 4 + - - 1 20/1 13,1 T1 + 0 0 2 30/1 13,9 T2 + 0 0 2 30/1 13,9 T3 + 0 0 2 30/1 13,5 Trong đó:
- T1, T2, T3 là thí nghiệm tại tâm phương án - X1, X2 là các thông số tối ưu
- x1, x2 là các biến mã không thứ nguyên tương ứng với X1, X2 - Y: Hàm mục tiêu, hàm lượng EL4 mg/kg