6. Bố cục của luận án
3.3.1. Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh
3.3.1.1. Quy hoạch thực nghiệm
Các bước thực hiện được trình bày ở phần b, mục 2.4.3.1.
thích của phương trình hồi quy (PTHQ) được trình bày cụ thể tại phụ lục 6.
Từ các số liệu thu được ở phần thực nghiệm, sau khi kiểm tra nghĩa của các hệ số b và tính tương thích, phương trình hồi quy thu được như trình bày tại biểu thức 3.1:
Y= 6,119 + 0,541x1 + 0,149x3 (3.1) Từ phương trình hồi quy 3 1 , có thể kết luận: Quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong dung môi ethanol 80 % trong các khoảng nhiệt độ chiết, thời gian chiết và tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu đã chọn thì quá trình chiết rễ mật nhân chỉ phụ thuộc vào 2 yếu tố đó là nhiệt độ chiết và thời gian chiết, yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu không thể hiện sự ảnh hưởng lên phương trình hồi quy 3 1 So sánh giữa hai hệ số b1 = 0,541 > b3 = 0,149, điều đó cho thấy sự ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ chiết x1 đến hiệu suất chiết nhiều hơn so với yếu tố thời gian chiết x3. Hai hệ số b1 và b3 đều là những giá trị dương, do đó, có thể kết luận rằng khi tăng nhiệt độ chiết và thời gian chiết thì hiệu suất chiết cũng tăng lên
Trong khoảng tỷ lệ giữa dung môi/ nguyên liệu là [20/1; 40/1] mL/g, khi thay đổi tỷ lệ này thì không ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình chiết Do đó, có thể kết luận rằng tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu tối ưu cho quá trình chiết mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol là 20/1 mL/g, kết quả này tương thích với các báo cáo của các tác giả Mardawani Mohamada và cộng sự vào năm 2013, khi khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu để chiết ra được hàm lượng eurycomanone, gallic acid, benzoic acid trong mật nhân lớn nhất là 20/1 mL/g, C.K. Foong và cộng sự vào năm 2015, khi nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố và kỹ thuật gia nhiệt đến hiệu suất chiết mật nhân cũng đã công bố rằng tỷ lệ 20/1 mL/g cho hiệu suất cao nhất [84] [94].
Vì vậy, ở giai đoạn sau của quá trình nghiên cứu, chúng tôi chỉ tối ưu hai yếu tố của quá trình chiết đó là nhiệt độ chiết và thời gian chiết, cố định tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20 mL/1g.
Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ chiết và thời gian chiết đến hiệu suất chiết được mô tả bằng bề mặt đáp ứng, trích xuất từ phần mềm xử lý số liệu Matlab R2016a. Bề mặt đáp ứng này mô tả rõ hơn phương trình hồi quy 3 1 như hình 3 4
Hình 3.4. Sự ảnh hƣởng đồng thời của nhiệt độ chiết và thời gian chiết đến hiệu suất chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %
Từ hình 3.4 cho thấy, khi cố định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, tăng nhiệt độ chiết và tăng thời gian chiết thì hiệu suất chiết rễ mật nhân cũng tăng lên Do vậy, để đạt hiệu suất chiết cao, chúng tôi thực hiện tăng nhiệt độ chiết và thời gian chiết trong khoảng giới hạn đã chọn.
3.3.1.2. Tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp leo dốc trên mặt mục tiêu
Trình tự thực hiện và kết quả tối ưu hóa thực nghiệm được trình bày tại phụ lục 6. Kết quả điều kiện tối ưu: {X1opt; X3opt} = {83,2 oC; 202,2 phút} và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20/1 (mL/g) với hiệu suất chiết là 7,188 %, Kết quả này khá tương đồng với nghiên cứu của nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh và Mai Hưng Trấn khi đã khảo sát điều kiện chưng ninh trong dung môi ethanol 96 % tốt nhất ở 80 oC, thời gian chưng ninh là 3 giờ và tác giả Hứa Thị Thu Thủy khi khảo sát và xác định được điều kiện chiết thích hợp để chiết bột vỏ rễ chùm ruột bằng phương pháp chưng ninh với dung môi ethanol 96 % với thời gian: 8 giờ, nhiệt độ: 80 oC [74] [95].
3.3.2. Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước lưu trong nước
3.3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân
Với kết quả phân lập, định danh, xác định thành phần, cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong rễ cây mật nhân đã nêu trên, nhận thấy, trong thành phần rễ cây mật nhân tại vùng núi huyện Ia Grai – tỉnh Gia Lai được chiết từ dung môi nước có mặt một số hợp chất có giá trị dược l , trong đó, nổi bật là hợp chất 9,10-
dimethoxycanthin-6-one (gọi tắt là EL4), có khả năng kháng độc tế bào ung thư máu ở người Fibrosarcoma HT-1080 [90].
Ngoài ra, hàm lượng hợp chất EL4 cũng chiếm tỷ trọng lớn trong các hợp chất alkaloid đã được phân lập với 6 mg EL4 thu được trong quá trình phân lập các hợp chất thuộc nhóm alkaloid từ 40 g cao chiết nước ban đầu.
Do đó, chúng tôi lựa chọn EL4 là chất chính vì vừa chiếm tỷ lệ lớn trong thành phần của chiết xuất, vừa thể hiện hoạt tính sinh học quý giá. Từ đó, chọn hàm mục tiêu của quá trình khảo sát là hàm lượng EL4 có trong dịch chiết.
Tham khảo các nghiên cứu đã công bố về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết rễ cây mật nhân, chúng tôi lựa chọn 3 yếu tố quan trọng nhất để tối ưu trong quá trình chiết là nhiệt độ chiết, tỷ lệ giữa dung môi/ nguyên liệu và thời gian chiết [26], [74]. Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố trên đến quá trình chiết mật nhân ở các nồng độ chất hòa tan, C. K. Foong và cộng sự vào năm 2015 đã công bố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 20/1 (mL/g), nhiệt độ 90 oC trong thời gian 90 phút thì điều kiện tối ưu nhưng khi ở thời gian 120 phút vẫn tiếp tục tăng [84].
Chúng tôi thực hiện khảo sát ảnh hưởng lần lượt của các yếu tố: Nhiệt độ, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và thời gian đến quá trình chiết rễ mật nhân. Kết quả cụ thể sau:
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết rễ mật nhân
Kết quả sự thay đổi của hàm lượng EL4 theo nhiệt độ chiết được thể hiện như hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng EL4
9 11 12 13.9 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 70 80 90 100 H àm lượng E L 4 (mg /k g) Nhiệt độ oC)
Kết quả ở hình 3.5 cho thấy, khi tăng nhiệt độ chiết thì hàm lượng EL4 thu được tăng và đạt hàm lượng cao nhất ở nhiệt độ 100 oC Điều này được giải thích như sau: Khi nhiệt độ tăng thì tốc độ khuếch tán tăng, độ nhớt của dung dịch giảm nên tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết. Ở nhiệt độ 100 o
C là nhiệt độ sôi của nước nên các phân tử nước linh động hơn làm cho quá trình thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu nhanh hơn kết hợp với dưới tác dụng của nhiệt độ cao sẽ giúp phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu từ đó góp phần làm cho cấu tử dễ dàng khuếch tán trong dung môi hơn Nhận xét: Nhiệt độ chiết để thu được hàm lượng EL4 cao nhất khi chiết trong thời gian 120 phút, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20/1 (mL/g) là 100 oC.
b. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến quá trình chiết rễ mật nhân Kết quả sự thay đổi của hàm lượng EL4 theo tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu được thể hiện như hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lƣợng EL4
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, khi tăng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu từ 10/1 đến 20/1 mL/g thì hàm lượng EL4 tăng và đạt cực đại tại tỷ lệ 20/1 mL/g Sau đó khi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu lên thì hàm lượng EL4 giảm Điều này được giải thích như sau: Với cùng một lượng nguyên liệu, khi lượng dung môi khác nhau thì khả năng hòa tan các chất khác nhau. Dung môi sử dụng là nước nên các chất có độ phân cực cao hơn, tan trong nước tốt hơn thì sẽ được trích ly ra trước Do đó, ở tỷ lệ
13.1 13.9 13.5 13.1 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 10/1 20/1 30/1 40/1 Hà m l ượng EL 4 ( mg /kg )
10/1 mL/g thì lượng dung môi chưa đủ để hòa tan hết EL4 có trong nguyên liệu. Khi tăng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu lên sẽ tạo điều kiện hòa tan hết cấu tử cần chiết và tại tỷ lệ 20/1 mL/g thì lượng dung môi vừa đủ để hòa tan hết cấu tử nên ở đây đạt giá trị cực đại. Khi tiếp tục tăng tỷ lệ môi/nguyên liệu, nhận thấy hàm lượng EL4 không tang nữa, nguyên nhân là do khi lượng dung môi nhiều thì hàm lượng EL4 có thể thất thoát trong quá trình gom phân đoạn và gây ra sự sai số thô trong quá trình phân tích trên HPLC Do đó, tại tỷ lệ 30/1 và 40/1 mL/g hàm lượng EL4 không tăng và có xu hướng giảm không đáng kể. Nhận xét: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp để thu được hàm lượng EL4 cao nhất ở nhiệt độ 100 o
C trong thời gian 120 phút là 20/1 (mL/g).
c. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết rễ mật nhân
Kết quả sự thay đổi của hàm lượng EL4 theo thời gian chiết được thể hiện như hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng EL4
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, khi tăng thời gian chiết từ thì hàm lượng EL4 tăng và đạt cực đại tại 120 phút Sau đó khi tiếp tục tăng thời gian chiết lên 150 phút thì hàm lượng EL4 có xu hướng giảm Điều này được giải thích như sau: Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa tan và khuếch tán vào trong dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn. Vì hợp chất EL4 là một
11.8 12.3 13.9 13.5 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 60 90 120 150 Hà m l ượng EL 4 (mg /kg ) Thời gian phút
alcaloid có phân tử lớn nên trong thời gian (60 – 90) phút đầu chủ yếu là các hợp chất có phân tử nhỏ được chiết ra do đó chất EL4 không thu được nhiều và hàm lượng tăng chậm. Trong 30 phút tiếp theo, khi các hợp chất có phân tử nhỏ đã được chiết ra hết thì tốc độ khuếch tán của EL4 tăng dẫn đến hàm lượng thu được tăng nhanh và đạt cực đại tại 120 phút Như vậy, 120 phút là khoảng thời gian đủ để trích ly hết EL4 nên khi tiếp tục kéo dài thời gian gian thì không có cấu tử để hòa tan thêm. Mặt khác, việc kéo dài thời gian chiết dưới tác dụng của nhiệt độ cao làm cho cấu tử có khả năng bị phân hủy dẫn đến hàm lượng cấu tử giảm dần khi tăng thời gian chiết lên 150 phút Như vậy, việc chiết trong thời gian quá dài không những làm giảm hiệu quả chiết đối với chất EL4 mà còn không có lợi về mặt kinh tế. Nhận xét: Thời gian chiết thích hợp để thu được hàm lượng EL4 cao nhất ở nhiệt độ 100 oC, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20/1 mL/g trong nước là 120 phút.
Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân trong dung môi nước: Thời gian chiết là 120 phút, nhiệt độ chiết là 100 o
C, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1 (mL/g) để thu được hàm lượng EL4 cao nhất là 13,9 mg/kg.
3.3.2.2. Tối ưu hóa quá trình chiết rễ mật nhân
Với kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân trong dung môi nước nêu trên, chúng tôi thực hiện tối ưu hóa các yếu tố này, các bước thực hiện được trình bày ở phần b, mục 2.4.3.2.
Các bước xác định hệ số b, kiểm tra nghĩa của hệ số b và kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy (PTHQ) được trình bày cụ thể tại phụ lục 6.
Từ các số liệu thu được ở phần thực nghiệm, sau khi kiểm tra nghĩa của các hệ số b và tính tương thích, phương trình hồi quy thu được như trình bày tại biểu thức 3.2:
Y = 13,70 + 0,550 x1 + 0,100 x2 (3.2) Từ phương trình hồi quy (3.2) ở trên, cho thấy, quá trình chiết rễ mật nhân trong các khoảng thời gian và tỷ lệ giữa dung môi/ nguyên liệu đã chọn đều phụ thuộc cả hai yếu tố đó là thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu So sánh giữa hai hệ số b1 = 0,550 > b2 = 0,100, điều đó cho thấy sự ảnh hưởng của yếu tố thời gian chiết x1 đến hiệu suất chiết nhiều hơn so với yếu tố dung môi/ nguyên liệu x3 Và với hệ số b1, b2 là giá trị dương nên thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tăng lên sẽ tỷ lệ thuận với chiều tăng của hàm lượng EL4
Trình tự thực hiện tối ưu hóa thực nghiệm được trình bày tại phụ lục 6
Kết quả điều kiện tối ưu: {X1opt; X2opt} = {199,2 phút; 22,4:1 mL/g} và nhiệt độ chiết là 100 oC với hàm lượng EL4 là 14,39 mg/kg.
Từ các kết quả tối ưu quá trình chiết, chúng tôi xây dựng hai quy trình chiết rễ mật nhân như sau:
a. Quy trình chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %
Quy trình chiết mật nhân trong ethanol 80 % được trình bày theo sơ đồ hình 3.8.
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong ethanol
Bột rễ mật nhân được chưng ninh hồi lưu cách thủy trong dung môi ethanol 80 % ở 83,2 oC trong thời gian 202,2 phút với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 20/1, sau đó, tiến hành lọc chân không, tiến hành cô quay chân không dich chiết thu được ở áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 50 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút đến khi đạt Bx = 50 %, thu được dịch chiết ethanol 80 %.
b. Quy trình chiết rễ cây mật nhân trong dung môi nước
Quy trình chiết mật nhân trong nước được trình bày theo sơ đồ hình 3.9. Bột rễ mật nhân
Chưng ninh hồi lưu (83,2 oC; 202,2 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 20/1)
Lọc chân không
Cô quay chân không (50 oC; Bx = 50 %) Dịch chiết ethanol
Ethanol 80 %
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong nƣớc
Bột rễ mật nhân được chưng ninh hồi lưu cách thủy trong nước ở 100 oC trong thời gian 199,2 phút với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 22,4/1, sau đó, tiến hành lọc chân không, tiến hành cô quay chân không dich chiết thu được ở áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 50 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút đến khi đạt Bx = 50 %, thu được dịch chiết nước.
Tiểu kết mục 3.3:
Chúng tôi đã xây dựng được hai quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước ở 100 o
C; 199,2 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 22,4/1 và trong ethanol 80 % ở 83,2 oC; 202,2 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 20/1. Từ sản phẩm dịch chiết của hai quy trình này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học của chúng với mục đích làm tăng giá trị dược lý của mật nhân tại miền Trung – Tây Nguyên.