Cây Gáo vàng là một lồi thực vật thân gỗ lâu năm, cao khoảng 20 m, nhánh ngang, vỏ nâu, gỗ vàng. Lá Gáo vàng cĩ phiến xoan rộng, to và dài khoảng 15-30 cm, đầu trịn, đáy trịn hay hơi hình tim, cuống 1 – 3 cm, lá bẹ xoan to, cao 2,5-3 cm (Hình 2.14). Gáo vàng cĩ hoa đầu dài khoảng 2-5 cm, to khoảng 4 cm, đài dính lại với nhau, vành ngà cao khoảng 7 mm, vịi nhụy thị dài 7 mm, quả thuộc dạng phì quả kép, hình trịn, to khoảng 2-3 cm (Phạm Hồng Hộ, 2003).
Ở Việt Nam, cây Gáo vàng phân bố rộng rãi ở các tỉnh thuộc vùng núi thấp (dưới
600 m) và trung du, vùng Đồng bằng do trồng hoặc chim đưa hạt giống đến (Đỗ Huy Bích, 2004). Ngồi ra, cây Gáo vàng cịn phân bố rộng rải ở các nước Châu Á nhiệt đới: Ấn Độ, Srilanca, Malaysia, Philipines. Cây Gáo vàng cho gỗ tốt, dùng trong xây dựng, đĩng tàu thuyền, đĩng đồ đạc trong gia đình (Trần Hợp, 2002). Gỗ cây Gáo vàng cĩ vị đắng, vỏ cây cĩ tác dụng hạ nhiệt chữa sốt, bồi bổ sức khỏe, chữa xơ gan cổ trướng (Đỗ Tất Lợi, 2014). Ở Campuchia, nhân dân vùng Xiêm Riệp dùng vỏ Gáo vàng làm thuốc giảm đau. Ở Philippines, bột Gáo vàng chữa lở loét, nước sắc chữa vết thương, tiêu chảy, đau răng. Ở New Guinea, nước ngâm của vỏ Gáo vàng chữa đau dạ dày. Ở Ấn Độ, vỏ cây gáo vàng được dùng trị rắn cắn (Đỗ Huy Bích, 2004).
Các nghiên cứu khoa học về cây cây Gáo vàng ở Việt nam đã được thực hiện như sàng lọc hoạt tính kháng oxy hĩa cây Gáo vàng bởi Phan Thị Anh Đào và Võ Thị Ngà (2015). Năm 2016, thành phần hĩa học của gỗ Gáo vàng được khảo sát bởi Võ Văn Lẹo (2016).
Hình 2.14: Cây Gáo Vàng (Nauclea orientalis L.) http://tropical.theferns.info
Trên thế giới cũng đã cĩ một số nghiên cứu quan trọng về cây Gáo vàng. Từ lá
Gáo vàng, Erdelmeier et al. (1992) đã được phân lập được 9 hợp chất alkaloid và đã
tiến hành các thử nghiệm gây độc trên tế bào ung thư bàng quang, tế bào ung thư cổ tử
cung. Từ rễ Gáo vàng, Sichaem et al. (2010) đã phân lập được 10 hợp chất trong đĩ cĩ
6 indole alkaloid (gồm naucleficine, naucleactonin A, naucleidinal, 19-epi- naucleidinal, strictosamide, và pumiloside), 2 secoiridoid (aligenoside và sweroside), 1 dẫn suất của naucleidinal và acid vanillic. Ngồi ra các hợp chất phân lập được cũng được kiểm tra độc tính trên các dịng tế bào HeLa và tế bào KB. Từ vỏ thân Gáo vàng, Tao et al. (2012) đã phân lập được 4 hợp chất triterpene (gồm 3β, 19α, 23, 24- tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid, 2β, 3β, 19α, 24-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid, 3-oxo-urs-12-ene-27, 28-dioic acid và quinovic acid-3-β-rhamnopyranoside) và thử hoạt tính kháng viêm. Kết quả cho thấy, hợp chất 3β, 19α, 23, 24-tetrahydroxyurs-12- en-28-oic acid cĩ hoạt tính kháng viêm tương đương chất kháng viêm chuẩn
hydrocortisone. Hoạt động kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của Gáo vàng cũng
được xác định (Cruz and Jubilo, 2014). Năm 2015, cũng từ rễ Gáo vàng đã phân lập được một dẫn xuất α-pinen mới cùng với 12 hợp chất đã biết, bao gồm 4 terpenoid (loganetin, loganin, sweroside, grandifloroside), 4 hợp chất phenol (gồm methyl protocatechuate, trans-p-coumaric acid, 3-(2,4- dihydroxylphenyl) propanoic acid, metyl 3-(2,4- dihydroxylphenyl) propanoate), 2 hợp chất glucoside coumarin (skimmin và adicardin), anthraquinone (emodin) và lignin ((+)-pinoresinol). Các hợp chất đã được thử hoạt động trung hịa gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxide hĩa lipid. Trong số đĩ, hợp chất grandifloroside và methyl protocatechuate thể hiện hoạt tính
kháng oxy hĩa mạnh (Phan et al., 2015). Năm 2018, từ thân và lá Gáo vàng đã phân
lập được hợp chất nauclorienine cĩ khả năng gây độc đối với năm dịng tế bào ung thư khác nhau ở người (Liu et al., 2018).
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 06/2015 đến tháng 12/2020.
Các địa điểm nghiên cứu:
Phịng thí nghiệm Sinh học, Bộ mơn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường
Đại học Cần Thơ: Thực hiện nội dung sàng lọc kháng oxy hĩa in vitro, thí nghiệm bảo
vệ gan và thử nghiệm tính an tồn trên chuột.
Phịng thí nghiệm Hĩa sinh, Bộ mơn Hĩa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ: Thực hiện nội dung chiết cao và phân lập chất.
Phịng xét nghiệm 144, Đường Nguyễn An Ninh, Phường Tân An, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ: Xét nghiệm enzyme ALT và AST trong huyết thanh chuột thí nghiệm bảo vệ gan.
Hội Đơng y Thị xã Bình Minh, Số 150, Tổ 1, Khĩm 5, Phường Thành Phước, Thị xã Bình Minh, Vĩnh Long; Đền thờ Nguyễn Trung Trực, Đường Nguyễn Cơng Trứ, phường Vĩnh Thanh, thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang; Chùa Tịnh Độ, Khĩm 2, Thị trấn Tri Tơn, tỉnh An Giang: Thực hiện nội dung điều tra các loại cây dược liệu được dùng điều trị bệnh gan.
3.1.2 Nguyên vật liệu
Mơ Lơng (VL_Pla201506010001), Mơ leo (VL_Psc201506010002), Trang to (VL_Idu201506010003), Lưỡi rắn (VL_Hco201506010004), Lưỡi rắn trắng (VL_Hdi201506010005), Gáo trắng (VL_Nca201507010007) và Gáo vàng (HG_Nor201507010007) được thu tại tỉnh Vĩnh Long và Hậu Giang. Các mẫu thực vật được định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo Cây Cỏ Việt Nam (quyển 3) của Phạm Hồng Hộ (2003) dưới sự hỗ trợ của PGS. TS. Ngơ Thanh Phong (phụ trách giảng dạy Thực vật học của Bộ mơn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ). Các mẫu hiện đang được lưu giữ tại Phịng thí nghiệm Động vật và Thực vật, Bộ mơn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ.
Trong nghiên cứu, chuột Mus musculus giống đực khỏe mạnh được sử dụng cĩ
khối lượng từ 20-30 g được cung cấp bởi viện Pasteur, thành phố Hồ Chí Minh (167 Pasteur, Phường 8, Quận 3, Thành phố Hồ Chí Minh). Chuột được nuơi ổn định trong mơi trường thí nghiệm từ 3-5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Trong thời gian thí nghiệm, chuột được nuơi ở điều kiện nhiệt độ phịng, trong lồng kính cĩ nắp lưới. Lồng nuơi, các thiết bị cho chuột ăn và uống nước được làm sạch và vệ sinh định kỳ.
3.1.3 Thiết bị và hĩa chất
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: máy ly tâm lạnh (Mikro 12- 24, Hettich, Đức), cân phân tích (AB104-S, Mettler Toledo, Thụy Sỹ), tủ sấy (BE 200, Memmert, Đức), bể ủ (Memmert, Đức), máy đo quang phổ (Thermo Scientific
Multiskan GO, Phần Lan), máy cơ quay chân khơng (Heidolph, Đức), chuồng nuơi
chuột và các dụng cụ cho uống.
Hĩa chất: Methanol (Trung Quốc), vitamin C (Sigma-Aldrich), carbon tetrachloride (Xilong), silymarin (Sigma-Aldrich), gallic acid (Merck), quercetin (Merck), Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Merck), 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (Sigma-Aldrich), thibarbituric acid (Merck), dầu olive (Italia), formol (Xilong), parafin (Xilong), sáp ong (Xilong), hematoxylin (Sigma-Aldrich), eosin Y (Sigma-Aldrich), 1,1,3, 3-tetramethoxypropane (Sigma-Aldrich, BCBP6297V, 99%), glutathione (Wako, WDF6267, 97%), atropine sulfate (Sigma-Aldrick, LRAC4087, 99,5%), diclofenac natri (Việt Nam, QT005130318, 99,9%), Baume Canada (Xilong) và một số hĩa chất khác.
3.2 Phương pháp nghiên cứu3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
3.2.2. Điều tra các loại cây dược liệu được dùng điều trị bệnh gan
Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp phỏng vấn người dân địa phương cĩ nhiều kinh nghiệm, kiến thức về sử dụng cây thuốc điều trị các bệnh về gan như: các lương y
ở các nhà thuốc nam, những người đi thu hái thuốc nam, các thầy cho thuốc nam ở các
chùa theo mẫu Phiếu điều tra cây thuốc trong cộng đồng (Viện Dược liệu, Bộ Y tế) (Phụ lục 3). Từ đĩ, thống kê lại theo họ và lập danh sách về các lồi cây làm thuốc
thường được dùng để điều trị bệnh gan theo họ. Kết quả điều tra làm cơ sở để chọn họ thực vật nghiên cứu.
Các địa điểm được chọn điều tra là nơi chuyên sử dụng các loại cây dược liệu
trong điều trị bệnh, 3 địa điểm được chọn gồm: (1) Hội Đơng y Thị xã Bình Minh (số
150, tổ 1, khĩm 5, Phường Thành Phước, Thị xã Bình Minh, Vĩnh Long); (2) Đền thờ Nguyễn Trung Trực (đường Nguyễn Cơng Trứ, phường Vĩnh Thanh, thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang); (3) Chùa Tịnh Độ (Khĩm 2, Thị trấn Tri Tơn, tỉnh An Giang).
3.2.3 Thu mẫu và chiết cao một số cây thuộc họ Cà phê
Dựa vào kết quả điều tra cây dược liệu sử dụng điều trị bệnh gan được thực hiện
ở mục 3.2.2, nghiên cứu đã chọn họ Cà phê thu mẫu các bộ phận một số cây gồm
Trang to (lá, hoa), Mơ lơng (lá), Mơ leo (lá), Gáo trắng (rễ, thân, lá), Gáo vàng (rễ, thân, lá), Lưỡi rắn (cả cây), và Lưỡi rắn trắng (cả cây).
Để khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa và bảo vệ gan của các loại thực vật nghiên cứu, các bộ phận từ các cây được chọn thu mẫu được chiết cao methanol. Mẫu thực vật sau khi thu về được rửa sạch, loại bỏ những phần bị sâu bệnh, nấm mốc, vàng héo, úa dập, để ráo nước rồi đem phơi khơ ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ, mẫu thực vật khơ được đem xay nhuyễn thành mẫu bột nguyên liệu cĩ kích thước hạt khoảng 60 mesh. Bột nguyên liệu được cho vào trong túi vải và chiết trong methanol bằng phương pháp ngâm. Mẫu (2000 g) được ngâm 3 lần trong methanol (5 lít/ lần), mỗi lần ngâm khoảng 48 giờ, dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại, cơ quay đuổi dung mơi thu được cao methanol tổng. Hiệu suất chiết cao được xác định theo cơng thức:
3.2.4 Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
Pha dung dịch cao chiết: Mỗi loại cao chiết được cân 0,1 gram cho vào 1000 µL methanol, khuấy cho cao chiết tan hồn tồn trong dung dịch, tiến hành ly tâm mẫu 3000 vịng/ phút trong 5 phút để loại bỏ phần cặn. Đây là các dung dịch cao chiết dùng cho các thí nghiệm hoặc để pha lỗng thành các các dung dịch cĩ nồng độ khác nhau tùy theo phương pháp thử nghiệm.
3.2.4.1 Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết
Định tính thành phần hĩa học của các cao chiết
Các cao chiết đã được kiểm tra định tính về sự hiện diện của các thành phần hĩa học như alkaloid, flavonoid, steroid, glycoside, saponin và tanin theo mơ tả của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007).
Phương pháp định lượng polyphenol tổng
Tổng hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp so màu Folin-
Ciocalteu (Singleton et al., 1999). Phản ứng gồm 250 µL cao chiết; 250 µL nước khử
ion và 250 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu (25%). Sau 8 phút, 250 µL dung dịch sodium
carbonate 10% đã được thêm vào và lắc đều. Sau khi ủ 30 phút ở 40oC, hỗn hợp phản
ứng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 765 nm. Hàm lượng polyphenol được xác định tương đương miligam gallic acid trên mỗi gram cao chiết (mg GAE/g cao chiết).
Phương pháp định lượng flavonoid tổng
Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo quy trình được mơ tả bởi Sultana
et al. (2009) cĩ hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 200 µL cao chiết; 200 µL nước
khử ion và 200 µL NaNO2 5% được ủ trong 5 phút. Sau đĩ, hỗn hợp được thêm vào 40
µL AlCl3 (10%) và ủ trong 6 phút. Tiếp theo, thêm 400 µL NaOH 1M. Thể tích cuối
cùng được điều chỉnh thành 1000 µL bằng nước khử ion và trộn kỹ. Sau 15 phút, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sĩng 510 nm. Hàm lượng flavonoid được xác định tương đương miligam quercetin trên mỗi gram cao chiết (mg QE/g cao chiết).
Phương pháp định lượng alkaloid tổng
Hàm lượng alkaloid được xác định bằng phương pháp hình thành phức hợp với
bromocresol green (BCG), tạo thành sản phẩm cĩ màu vàng (Shamsa et al., 2008).
Cao chiết (1 mL) cho phản ứng với 1 mL dung dịch HCl 2N. Sau khi phản ứng 5 phút thì dung dịch trên được lọc bằng giấy lọc để loại bỏ cặn. Cho dung dịch trên vào bình tách chiết lần lượt thêm vào 5 mL BCG và 5 mL dung dịch đệm phosphate (pH 4,7). Cuối cùng, hỗn hợp được lắc mạnh bằng bình tách chiết với 10 mL dung dịch chloroform, sau 2 phút phản ứng ở nhiệt độ phịng, tiến hành đo độ hấp thụ quang phổ bước sĩng 470 nm. Hàm lượng alkaloid (mg AE/g cao chiết) trong các dịch ngoại bào được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn atropine.
3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
Khảo sát hiệu quả trung hịa gốc tự do DPPH
Các cao chiết được khảo sát hiệu quả kháng oxy hĩa theo cơ chế trung hịa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Thử nghiệm DPPH được thực hiện theo phương pháp của Shekhar and Anju (2014) cĩ hiệu chỉnh như sau: Cao chiết được pha lỗng ở các nồng độ khác nhau (10, 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL) gồm 200 µL được phản ứng với 200 µL DPPH (6×10-4 M). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối, ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 60 phút. Sau đĩ, hỗn hợp được đo độ hấp thu quang phổ
ở bước sĩng 517 nm. Vitamin C được sử dụng làm đối chứng dương và khảo sát hiệu
µg/mL. Thử nghiệm khảo sát hoạt tính trung hịa gốc tự do DPPH được thực hiện lặp lại 3 lần/ nồng độ và lấy giá trị trung bình. Hiệu suất trung hịa gốc tự do DPPH của cao chiết và vitamin C được xác định dựa vào cơng thức:
Trong đĩ: Ac (A control) là giá trị độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng âm (methanol); As (A sample) là giá trị độ hấp thu quang phổ của dung dịch mẫu thử
Ngồi ra, hiệu quả kháng oxy hĩa của các cao chiết và vitamin C cịn được xác định dựa vào nồng độ mà tại đĩ cao chiết hay vitamin C trung hịa được 50% lượng
gốc tự do DPPH (Effective concentration of 50%, EC50). Giá trị EC50 được tính dựa
vào phương trình hồi quy tuyến tính của hiệu suất trung hịa gốc tự do DPPH.
Khảo sát khả năng khử của các cao chiết
Dung dịch cao chiết được pha lỗng thành các nồng độ: 100, 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/mL. Đồng thời, butylated hydroxyanisole (BHA) cũng được pha theo dãy nồng độ sau: 0, 10, 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL để làm đối chứng dương.
Khả năng khử của các cao chiết và BHA được thực hiện theo phương pháp của Oyaizu (1986) cĩ hiệu chỉnh như sau: 0,5 mL dung dịch cao chiết hoặc BHA theo các nồng độ đã pha và 0,5 mL đệm phosphate (0,2 M, pH=6,6) tiếp tục thêm vào 0,5 mL
K3Fe(CN)6 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong 20 phút. Sau đĩ, hổn hợp được thêm
tiếp 0,5 mL CCl3COOH 10% rồi ly tâm 3000 vịng/ phút trong 10 phút. Dịch ly tâm
được rút 0,5 mL, thêm vào 0,5 mL nước và 0,1 mL FeCl3 0,1%, lắc đều. Tiến hành đo
độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng ở bước sĩng 700 nm. Khả năng khử của các cao chiết được xác định dựa vào hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương
BHA và nồng độ cao chiết khử được 50% gốc tự do (EC50).
Khảo sát hiệu quả kháng oxy hĩa tổng
Khả năng kháng oxy hố tổng (Total antioxidant capacity-TAC) của các cao chiết được đánh giá bằng phương pháp phosphomolybdenum của Prieto et al. (1999). Phương pháp này dùng đánh giá cả chất kháng oxy hĩa hịa tan trong nước và chất
kháng oxy hĩa hịa tan trong dầu (Aliyu et al., 2013). Hỗn hợp phản ứng gồm 0,3 mL
cao chiết kết hợp với 3 mL dung dịch thử (0,6 M acid sulfuric, 28 mM sodium
phosphate và 4 mM ammonium molybdate). Hổn hợp phản ứng được ủ ở 95oC trong
90 phút. Sau khi ủ, hỗn hợp phản ứng được làm mát ở nhiệt độ phịng và tiến hành đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 695 nm. Methanol (0,3 mL) thay cho cao chiết được sử dụng làm đối chứng âm. Khả năng kháng oxy hố tổng của các cao chiết thể
3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết
Các cao chiết cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa sẽ được khảo sát hoạt tính kháng viêm
in vitro. Khả năng kháng viêm của cao chiết được khảo sát thơng qua hoạt động ức chế
sự biến tính protein được thực hiện theo phương pháp của Shah et al. (2017) cĩ hiệu
chỉnh. Dung dịch thử 1 mL (ở các nồng độ khác nhau) được trộn với 1 ml dung dịch
BSA 5%. Sau đĩ, hỗn hợp được ủ ở 27oC trong 15 phút. Sự biến tính protein được tạo
ra bằng cách giữ hỗn hợp phản ứng ở 60oC trong 10 phút. Sau khi làm mát, tiến hành
đo mật độ quang tại bước sĩng 660 nm. Thuốc kháng viêm diclofenac được sử dụng như chất đối chứng dương. Khả năng ức chế sự biến tính protein của các cao chiết được xác định theo cơng thức sau: % Ức chế = 100 (1-Vt/Vc). Trong đĩ, Vt: giá trị mật độ quang của mẫu thử, Vc: giá trị mật độ quang của mẫu đối chứng khơng cĩ cao chiết.
3.2.5 Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết trên mơ hình chuột