Định tính sơ bộ thành phần hĩa học cĩ trong các cao methanol được chiết từ một số thực vật thuộc họ Cà phê cho thấy sự cĩ mặt của các thành phần cĩ hoạt tính sinh học khác nhau như: flavonoid, phenol, alkaloid, tannin, terpenoid, glycoside (Phụ lục 1.2).
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng với chất chuẩn là acid gallic trong dãy nồng độ từ 2 đến 10 µg/mL (y=0,161x+0,0807; R²=0,998). Hàm lượng flavonoid tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng với chất chuẩn là quercetin trong dãy nồng độ từ 20 đến 120 µg/mL (y=0,0087x–0,0069; R²=0,989). Hàm lượng alkaloid tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng với chất chuẩn là atropine trong dãy nồng độ từ 10 đến 500 µg/mL (y=0,0006x+0,0386; R²=0,996). Trên cơ sở các phương trình đường chuẩn này, hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng và alkaloid tổng cĩ trong các cao chiết được xác định tương đương acid gallic, quercetin và atropine được trình bày ở Bảng 4.3.
Dựa vào kết quả nghiên cứu ở Bảng 4.3 cho thấy, các cao chiết từ một số thực vật thuộc họ Cà phê cĩ chứa hàm lượng polyphenol tổng dao động từ 16,5±0,52 mg GAE/g (cao chiết lá Mơ lơng) đến 762,3±62,5 mg GAE/g (cao chiết hoa Trang to). Hàm lượng flavonoid tồn phần dao động từ 10,6±0,22 mg QE/g (cao chiết Lưỡi rắn) đến 679,5±35,6 mg QE/g (cao chiết hoa Trang to) và hàm lượng alkaloid tổng dao động từ 58,6±2,4 mg AE/g (cao chiết lá Gáo trắng) đến 895,4±18,1mg AE/g (cao chiết rễ Gáo vàng).
Bảng 4.3: Hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết từ một số thực vật họ Cà phê Cao chiết (n=3) Lá Mơ Lơng Lá Mơ Leo Lá Trang To Hoa Trang to Lá Gáo Vàng Vỏ thân Gáo vàng Rễ Gáo vàng Lá Gáo trắng Vỏ thân Gáo trắng Rễ Gáo trắng Lưỡi rắn Lưỡi rắn trắng
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức 5%.
Nhìn chung các cao chiết nghiên cứu cĩ hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng khá cao. Cĩ 5 cao chiết gồm hoa Trang to, lá Trang to, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng và rễ Gáo trắng cĩ hàm lượng polyphenol và flavonoid cao vượt trội, trong khi cao chiết cĩ hàm lượng alkaloid tổng cao nhất là rễ Gáo vàng. Như vậy, kết quả nghiên cứu chứng minh rằng các cao methanol được chiết từ một số thực vật thuộc họ Cà phê cĩ chứa nhiều hợp chất sinh học đầy tiềm năng ứng dụng.
4.3.2 Hiệu quả kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
4.3.2.1 Hiệu quả trung hịa gốc tự do 2,2- diphenyl- 1 picrylhydrazyl (DPPH) của các cao chiết
Hoạt tính kháng oxy hĩa của các cao methanol được chiết từ một số cây thuộc họ Cà phê thể hiện qua hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH được trình bày trong Bảng 4.4. Kết quả cho thấy hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết, khi tăng nồng độ của cao chiết thì hiệu suất loại bỏ gốc tự do tăng. Kết quả trình bày ở Bảng 4.4 cho thấy, các cao methanol lá Trang to, hoa Trang to, lá Gáo trắng và vỏ thân Gáo trắng cĩ hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH cao hơn so với các loại cao chiết cịn lại. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH của cao lá Trang to, hoa Trang to, lá Gáo trắng và vỏ Gáo trắng tăng tuyến tính ở dãy nồng độ được khảo sát. Ở nồng độ cao chiết 10 µg/mL, hiệu suất loại bỏ gốc tự do của các cao chiết dao động từ 5,6% đến 21,5%. Hiệu suất loại bỏ gốc tự do của cao chiết tăng dần theo thứ tự cao lá Trang to (9,7%), cao hoa Trang to (10,5%), cao vỏ thân Gáo trắng (14,4%) và cao lá Gáo trắng (15,3%). Ở nồng độ 100 µg/mL cao chiết, các cao chiết cĩ hiệu suất loại bỏ gốc tự do đạt được trên 80% gồm cao lá Trang to
(80,4%), cao hoa Trang to (81,4%), cao vỏ Gáo trắng (82,9%) và cao lá Gáo trắng (84,9%). Các cao chiết cĩ hiệu suất loại bỏ gốc tự do đạt từ 50,7% đến 77,6% ở nồng độ khảo sát 100 µg/mL cao chiết, lần lượt tăng là cao lá Mơ leo, cao rễ Gáo vàng, cao lá Gáo vàng, cao lá Mơ lơng, cao rễ Gáo trắng và cao vỏ Gáo vàng. Hiệu suất loại bỏ gốc tự do
ở nồng độ khảo sát 100 μg/mL của cao methanol Lưỡi rắn (20,5%) và Lưỡi rắn trắng
Bảng 4.4: Hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH của các cao chiết Cao chiết (n=3) 10 LMLO 5,6±1,04j 13,5±2,92 LMLE 10,2±2,99g 11,1±3,81 LTT 9,7±2,33h 16,2±2,74 HTT 10,5±2,71i 21,5±4,64 LGV 11,8±0,76j 17,9±1,27 VTGV 20,4±0,05j 26,8± 0,10 RGV 7,79±1,43j 15,2±0,96 LGT 15,3±1,09j 27,1±3,56 VTGT 14,4±2,58g 29,9±1,92 RGT 21,5±5,84g 26,0±3,68 LR 1,52±0,20j 3,85±0,11 LRT 0,65± 0,17j 2,19±0,37 Chất chuẩn 4 Vitamin C 11,7±0,79i 22,9±1,31
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một hàng giống nhau khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức 5%. LMLO: lá Mơ lơng; LMLE: lá Mơ leo; LTT: lá Trang to; HTT: hoa Trang to; LGV: lá Gáo vàng; VTGV: vỏ thân Gáo vàng; RGV: rễ Gáo vàng; LGT: lá Gáo trắng; VTGT: vỏ thân Gáo trắng; RGT: rễ Gáo trắng; LR: Lưỡi rắn; LRT: Lưỡi rắn trắng.
Khả năng kháng oxy hĩa cũng như hiệu quả loại bỏ gốc tự do của các cao chiết từ một số cây thuộc họ Cà phê cũng được so sánh dựa vào hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do (Effective Concentration of 50%, EC50). EC50 của các cao chiết được tính dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của từng cao và trình bày trong Bảng 4.5.
Bảng 4.5: EC50 của các cao chiết một số cây thuộc họ Cà Phê
Tên cao chiết (n=3) Lá Mơ lơng Lá Mơ leo Lá Trang to Hoa Trang to Lá Gáo vàng Vỏ Gáo vàng Rễ Gáo vàng Lá Gáo trắng Vỏ Gáo trắng Rễ Gáo trắng Lưỡi rắn Lưỡi rắn trắng Vitamin C
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5%; Dấu”-“là khơng xác định.
Hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do của các cao chiết (EC50) trình bày trong Bảng 4.5
cho thấy, nồng độ cao chiết để đạt EC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hĩa các cao
chiết càng mạnh và ngược lại. Trong 12 cao chiết khảo sát, cĩ 10 cao cĩ khả năng kháng
oxy hĩa, giá trị EC50 dao động từ 51,5 μg/mL đến 107,8±1,22 μg/mL. Trong đĩ, nhĩm cĩ
EC50 thấp lần lượt gồm cao lá Gáo trắng (51,5±1,61 μg/mL), cao vỏ Gáo trắng (52,4±1,93 μg/mL), cao vỏ Gáo vàng (54,4±0,2 μg/mL), cao hoa Trang to (56,5±1,65 μg/mL), cao rễ Gáo trắng (56,1±3,93 μg/mL) và cao lá Trang to (59,3±1,26 μg/mL). Đây là các cao chiết cĩ khả năng loại bỏ 50% gốc tự do DPPH mạnh. Nhĩm cao chiết cĩ giá trị
EC50 cao hơn là cao lá Gáo vàng (73,0±0,99 μg/mL), cao lá Mơ lơng (67,3±1,35 μg/mL),
cao rễ Gáo vàng (73,4±1,25 μg/mL) và tiếp theo là cao lá Mơ leo (107,8±1,22 μg/mL).
Các cao chiết nghiên cứu đều cĩ EC50 cao hơn vitamin C (EC50=18,3±0,33 μg/mL) cũng
cĩ nghĩa là cĩ khả năng kháng oxy hĩa thấp hơn vitamin C. Cụ thể, cao lá Gáo trắng và cao vỏ thân Gáo trắng cĩ giá trị EC50 khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05) và đều
thấp hơn vitamin C 2,8 lần; Cao rễ Gáo trắng và cao vỏ thân Gáo vàng cĩ giá trị EC50
khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê và đều thấp hơn vitamin C khoảng 3 lần; Cao lá Trang to và cao hoa Trang to cĩ giá trị EC50 khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê
và đều thấp hơn vitamin C khoảng 3,2 lần; Đặc biệt, cao Lưỡi rắn và cao Lưỡi rắn trắng
khơng xác định được giá trị EC50 ở các nồng độ được khảo sát. Từ kết quả trên cĩ thể kết
luận các cao chiết đều cĩ khả năng kháng oxy hĩa khá cao trừ cao Lưỡi rắn và cao Lưỡi rắn trắng.
Khả năng kháng oxy hĩa của các cao chiết thực vật cao hay thấp được biết là nhờ các thành phần hĩa học cĩ trong các cao chiết. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng kháng oxy hĩa của các cao chiết liên quan đến các hợp chất thuộc nhĩm polyphenol, flavonoid và alkaloid. Kết quả định lượng thành phần polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết một số cây thuộc họ Cà phê cũng được trình bày trong Bảng 4.3. Từ đĩ cho thấy các cao chiết nghiên cứu cĩ hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng từ khá cao đến cao, đặc biệt các loại cao chiết cĩ khả năng kháng oxy hĩa được phân tích ở trên cĩ hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng cao. Điều này cũng một lần nữa chứng minh rằng hoạt tính kháng oxy hĩa của các cao chiết cĩ liên quan đến các hợp chất thứ cấp cĩ trong các cao chiết, đáng chú ý là thành phần polyphenol tổng.
So với một số lồi thực vật khác như Cà gai leo, Hà thủ ơ trắng (Streptocaulon
juventas Merr.) đã được khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa loại bỏ gốc tự do DPPH, cho
thấy cả hai cao methanol tổng đều cĩ giá trị EC50 cao hơn các cao methanol trong nghiên
cứu hiện tại. Ở nồng độ từ 51,5±1,61 µg/mL đến 107,8±1,2 µg/mL, các cao chiết nghiên cứu đã cĩ thể ức chế được 50% gốc tự do trong khi cao methanol Cà gai leo ở nồng độ 349 µg/mL (Nguyen and Eun, 2011) và cây Hà thủ ơ trắng ở nồng độ 1734 µg/mL (Đái
Thị Xuân Trang và ctv., 2015) mới cĩ thể ức chế được 50% gốc tự do. Tuy nhiên, khả
năng kháng oxy hĩa của các cao chiết nghiên cứu vẫn thấp hơn so với cao lá Dành dành (Gardenia jasminoides) cĩ hiệu suất loại bỏ 50% gốc tự do DPPH ở nồng độ tương ứng là 48,9±0,85 g/mL. Ngồi ra, cao vỏ thân Dành dành cĩ hiệu suất loại bỏ 50% gốc tự do DPPH ở nồng độ 61,17±0,65 g/mL (Sarmah and Baishya, 2014) tương đương với cao lá Gáo vàng trong nghiên cứu hiện tại.
4.3.2.2 Khả năng khử của các cao chiết
Khả năng kháng oxy hĩa của các cao chiết từ một số thực vật họ Cà phê được xác định thơng qua hoạt tính khử sắt dựa vào hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương chất chuẩn BHA cĩ trong các cao chiết. Hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương μg/mL BHA cĩ trong các cao chiết được tính dựa vào phương trình đường chuẩn của
Bảng 4.6: Hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương BHA cĩ trong 100 g/mL cao chiết Cao chiết (100 g/mL) Lá Mơ lơng Lá Mơ leo Lá Trang to Hoa Trang to Lá Gáo vàng Vỏ thân Gáo vàng Rễ Gáo vàng Lá Gáo trắng Vỏ thân gáo trắng Rễ Gáo trắng Lưỡi rắn Lưỡi rắn trắng
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5%; Dấu “-“ là khơng xác định.
Dựa vào kết quả trình bày trong Bảng 4.6, ở nồng độ 100 g/mL các cao chiết một số thực vật họ Cà phê cho thấy cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương µg/mL BHA khá cao, hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương µg/mL BHA của các cao chiết một số thực vật họ Cà phê khác biệt cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,5). Hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương BHA của cao hoa Trang to (26,3±0,86 g/mL) cao nhất nhưng khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05) với cao vỏ thân Gáo trắng (25,8±0,65 g/mL). Tuy nhiên, cao vỏ thân Gáo trắng cao khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với cao rễ Gáo trắng (25,0±0,18 g/mL). Cao vỏ thân Gáo vàng (21,0±0,21 g/mL) cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương BHA cao thứ 4, kế tiếp là cao chiết lá Trang to (15,8±0,18 g/mL) cao gấp 1,3 lần cao chiết lá Mơ lơng (14,3±0,91 g/mL) và cao gấp 2,2 lần cao chiết lá Mơ leo (9,45±0,5 g/mL). Đối với các cao chiết cây Gáo vàng, cao chiết vỏ thân Gáo vàng cao gấp 1,9 lần cao chiết lá Gáo vàng (10,8±0,52 g/mL) và gấp 3 lần cao chiết rễ Gáo vàng (7,05±0,39 g/mL). Trong khi đĩ, cao chiết Lưỡi rắn trắng và cao chiết Lưỡi rắn lần lượt thuộc nhĩm cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương BHA thấp nhất. Riêng cao chiết lá Gáo trắng, ở nồng độ 10 g/mL cao chiết cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương BHA (25,6±0,34 g/mL) cao nhất trong các cao chiết được nghiên cứu. Kết quả cho thấy, khả năng khử sắt của cao lá Gáo trắng là cao nhất, thấp nhất là cao Lưỡi rắn.
Bảng 4.7: EC50 của các cao chiết trong phương pháp khử sắt Cao chiết (n=3) Lá Mơ lơng Lá Mơ leo Lá Trang to Hoa Trang to Lá Gáo vàng Vỏ thân Gáo vàng Rễ Gáo vàng Lá Gáo trắng Vỏ thân gáo trắng Rễ Gáo trắng Lưỡi rắn Lưỡi rắn trắng BHA
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5%; Dấu “-“ là khơng xác định
Mặt khác, khả năng khử sắt của các cao chiết một số thực vật họ Cà phê được so sánh với BHA ở cùng một giá trị Abs xác định, từ đĩ suy ra được nồng độ của mẫu khi đạt được giá trị Abs này. Nồng độ của mẫu càng cao thì khả năng khử sắt càng yếu và ngược lại. Nồng độ của BHA và các cao chiết một số thực vật họ Cà phê khi đạt giá trị
Abs = 0,5 (được xem như là giá trị EC50) được trình bày trong Bảng 4.7. Kết quả cho
thấy, nồng độ đạt EC50 của cao lá Gáo trắng là 16,6±0,29 µg/mL là thấp nhất, tiếp đến là
BHA 30,1±0,13 µg/mL. Tiếp theo là nhĩm cao chiết cĩ EC50 dưới 200 µg/mL, cĩ 3 cao
chiết EC50 tăng lần lượt là vỏ thân Gáo trắng (140±8,02 µg/mL), hoa Trang to (162±3,26
µg/mL) và vỏ thân Gáo vàng (183,9±1,13 µg/mL). Nhĩm cao chiết cĩ EC50 trong khoảng
từ 200-300 µg/mL là lá Trang to (218,9±1,46 µg/mL) và rễ Gáo trắng (282,8±36,56 µg/mL). Bốn cao chiết cĩ giá trị EC50 trên 300µg/mL là lá Gáo vàng (325,3±11,51µg/mL), lá Mơ lơng (381,2±3,29 µg/mL), rễ Gáo vàng (375,9±25,39 µg/mL)
và cao chiết lá Mơ leo cĩ EC50 cao nhất (582,2±7,68 µg/mL). Cao chiết Lưỡi rắn và Lưỡi
rắn trắng khơng xác định được giá trị EC50 ở các nồng độ được khảo sát.
Khả năng khử sắt của các cao chiết thực vật họ Cà phê đều thấp hơn so với chất
chuẩn BHA trừ cao chiết lá Gáo trắng. Dựa vào nồng độ cao chiết đạt được EC50 của các
cao được khảo sát cĩ thể kết luận, khả năng khử sắt của các cao chiết giảm dần theo thứ tự cao lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng, hoa Trang to, vỏ thân Gáo vàng, lá Trang to, rễ Gáo trắng, lá Gáo vàng, lá Mơ lơng, rễ Gáo vàng và lá Mơ leo.
4.3.2.3 Khả năng kháng oxy hĩa tổng của các cao chiết
Khả năng kháng oxy hĩa tổng của các cao chiết thực vật họ Cà phê được khảo sát bằng phương pháp phosphomolybdenum dựa vào hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương chất chuẩn trolox cĩ trong các cao chiết. Hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương μg/mL trolox cĩ trong các cao chiết được tính dựa vào phương trình đường chuẩn của trolox y=0,145x+0,163 (R²=0,989), kết quả trình bày trong Bảng 4.8. Kết quả từ Bảng 4.8 cho thấy, các cao chiết thực vật họ Cà phê cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương chất kháng oxy hĩa chuẩn trolox trong 100 g/mL cao chiết rất khác nhau. Trong các cao chiết từ cây Gáo trắng, hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương trolox trong 100 g/mL cao chiết ở lá Gáo trắng (6,22±0,01 g/mL) cao nhất, kế đến là vỏ thân Gáo trắng (5,38±0,02 g/mL) và rễ Gáo trắng (5,25±0,02 g/mL). Cao chiết vỏ thân Gáo vàng cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương trolox (5,27±0,03 g/mL) khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với rễ Gáo trắng. Nhĩm cao chiết cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương trolox cao đứng thứ 2 gồm các cao chiết hoa Trang to (4,68±0,08 g/mL), lá Trang to (4,22±0,02 g/mL) và lá Gáo vàng (4,1±0,01 g/mL). Nhĩm thứ 3 là các cao chiết rễ Gáo vàng (3,46±0,03 g/mL), lá Mơ lơng (3,07±0,02 g/mL) và lá Mơ leo (2,77±0,02 g/mL). Nhĩm cĩ hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương trolox thấp nhất là cao chiết Lưỡi rắn và Lưỡi rắn trắng.
Bảng 4.8: Hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương g/mL trolox cĩ trong 100 g/mL cao chiết Cao chiết (100 g/mL) Lá Mơ lơng Lá Mơ leo Lá Trang to Hoa Trang to Lá Gáo vàng Vỏ thân Gáo vàng Rễ Gáo vàng Lá Gáo trắng Vỏ thân gáo trắng Rễ Gáo trắng Lưỡi rắn Lưỡi rắn trắng
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống