Cao ethyl acetate được hịa tan vào một lượng tối thiểu dung mơi Ea:MeOH (80:20), tiếp theo cho hấp phụ với 120 g silica gel, làm khơ dung mơi và nghiền mịn thành bột, sau đĩ tiến hành sắc ký nhanh-cột khơ với các thơng số sau:
Đường kính cột: d=20 cm.
Khối lượng silica gel nhồi cột: 450 g. Chiều cao lớp silica gel: l=5 cm. Khối lượng cao ethyl acetate: 101,6 g. Dung mơi ổn định: Hex:Ea (5:5).
Dung mơi giải ly cột được tăng dần độ phân cực bằng Ea và MeOH. Dung dịch sau khi ra khỏi cột được chứa trong các lọ cĩ dung tích 150 mL và được theo dõi quá trình
chạy cột bằng SKLM, hiện vết bằng đèn UV, hiện hình bằng thuốc thử vaniline/H2SO4
(5%) trong methanol và gia nhiệt trên bếp điện. Các mẫu cho kết quả SKLM giống nhau
(về màu vết và Rf) được gom thành một phân đoạn, thu được 12 phân đoạn tương ứng lần
lượt E1-E12.
Kết quả sắc ký cột trên cao phân đoạn ethyl acetate thu được 12 phân đoạn chính (ký hiệu E1-E12). Trong đĩ, phân đoạn E1, E2 được chọn để khảo sát tiếp. Kết quả sắc ký cột được trình bày chi tiết ở Bảng 4.24.
Bảng 4.24: Tĩm tắt kết quả sắc ký nhanh-cột khơ của cao ethyl acetate Hệ dung mơi giải ly Hex:Ea (5:5) Ea (100%) Ea:Me (9:1) Ea:Me (7:3) Ea:Me (5:5) Me (100%) Tổng khối lượng Hiệu suất
Quan sát sắc ký lớp mỏng phân đoạn E1 cĩ vệt màu cam và phân đoạn E2 cĩ vệt màu cam, vàng với vết màu rõ rệt dễ quan sát nên được chọn để tiếp tục phân đoạn.
Phân đoạn E1:
Phân đoạn E1 đã được tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với các thơng số sau: Đường kính cột: d=3,0 cm.
Chiều dài cột: l=19 cm.
Khối lượng silica gel nhồi cột: 60 g. Khối lượng đoạn E1: 6,4646 g. Dung mơi ổn định cột Hex:DC (5:5).
Hệ dung mơi giải ly ban đầu là Hex:DC (5:5), tăng dần độ phân cực bằng dichloromethane và methanol. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM, hiện vết bằng đèn UV và thuốc thử vanilline trong H2SO4, gia nhiệt trên bếp điện. Các lọ cho vết giống nhau sẽ được gom chung, cơ đuổi dung mơi thu được 9 phân đoạn ký hiệu là E1.1-E1.9. Quá trình thực hiện được tĩm tắt ở Bảng 4.25.
Bảng 4.25: Tĩm tắt kết quả sắc ký cột pha thường phân đoạn E1 Hệ dung mơi giải ly Hex:DC (5:5) Hex:DC (2:8) DC (100%) DC:Me (98:2) DC:Me (97:3) DC:Me (9:1)
Phân đoạn E1.2 (45,8 mg) được thực hiện sắc ký cột pha thường nhiều lần với dung mơi rửa giải duy nhất là Hex:DC (2:8), thu được hợp chất ở dạng tinh thể màu cam, kí hiệu là NO01 (10,7 mg). Tiến hành gửi ghi phổ để xác định cấu trúc. Kết quả ghi phổ được trình bày ở Phụ lục 2.
Phân đoạn E2:
Phân đoạn E2 đã được tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với các thơng số sau: Đường kính cột: d=3,0 cm.
Chiều dài cột: l=19 cm.
Khối lượng silica gel nhồi cột: 60 g. Khối lượng đoạn E2: 4,4806 g. Dung mơi ổn định cột Hex:DC (4:6).
Hệ dung mơi giải ly ban đầu là Hex:DC (4:6), tăng dần độ phân cực bằng dichloromethane và methanol. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM, hiện vết bằng đèn UV và thuốc thử vanilline trong H2SO4, gia nhiệt trên bếp điện. Các lọ cho vết giống nhau sẽ được gom chung, cơ đuổi dung mơi thu được 6 phân đoạn ký hiệu là E2.1-E2.6. Quá trình thực hiện được tĩm tắt ở Bảng 4.26.
Bảng 4.26: Tĩm tắt kết quả sắc ký cột pha thường phân đoạn E2 Hệ dung mơi giải ly Hex:DC (4:6) Hex:DC (3:7) Hex:DC (2:8) DC (100%) DC:Me (9:1) Tổng khối lượng Hiệu suất
Phân đoạn E2.2 (3252,7 mg) được tiếp tục thực hiện sắc ký cột pha thường với dung mơi tích hợp thu được 12 phân đoạn kí hiệu từ E2.2.1-E2.2.12. Kết quả sắc ký cột phân đoạn trên được trình bày trong Bảng 4.27.
Bảng 4.27: Tĩm tắt kết quả sắc ký cột pha thường phân đoạn E2.2 Hệ dung mơi giải ly Hex:DC (5:5) Hex:DC (4:6) Hex:DC (3:7) DC (100%) DC:Me (95:5) Tổng khối lượng Hiệu suất
Từ phân đoạn E2.2.9, tiếp tục thực hiện sắc ký cột pha thường với hệ dung mơi thích hợp, kết hợp với phương pháp kết tinh lại trong chloroform:methanol thu được tinh thể màu trắng, khối lượng 10,3 mg, được kí hiệu là NO02.
khối lượng 10,3 mg. Kết quả hình dạng và sắc ký lớp mỏng của hợp chất NO01, NO02 được trình bày ở Hình 4.9.
A. A. Hình dạng và kết quả SKLM của hợp chất NO01
a. UV 254 nm; b. UV 365 nm;
c.Hiện hình bằng Vanilin/H2SO4; d. Hình dạng, màu sắc (C (100%), DC (100%), Ea (100%))
B. Hình dạng và kết quả SKLM của hợp chất NO02
a.Hiện hình bằng Vanilin/H2SO4; b. Hình dạng, màu sắc (C:Me (9:1), DC:Me (9:1), Ea:Me (9:1))
Hình 4.9: Hình dạng và kết quả SKLM của 2 hợp chất được phân lập Hợp chất NO01 và NO02 được ghi các loại phổ 1H-NMR, 13
C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và COSY (Phụ lục 2).