Nghiên cứu sử dụng mơ hình in vivo gây tổn thương gan chuột với tác nhân
carbon tetrachloride (CCl4) với các ưu điểm gồm cơ chế gây độc gan được biết rõ, các
biến đổi trên động vật về mơ học và huyết học tương tự như trên người.
3.2.5.1 Khảo sát khả năng làm giảm enzyme AST và ALT
Các cao chiết cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa và kháng viêm được tiến hành khảo sát hiệu quả bảo vệ gan trên mơ hình chuột theo mơ tả của Kang and Koppula (2014) cĩ
hiệu chỉnh. Chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 liều 2,5 mL/kg khối lượng
chuột (20% CCl4 trong dầu olive). Cao chiết được thử nghiệm ở các liều 100, 200 hoặc
400 mg/kg khối lượng chuột (Singhal and Gupta, 2012; Meharie et al., 2020). Tinh
chất silymarin liều 16 mg/kg được sử dụng như thuốc bảo vệ gan đối chứng (Duong et
al, 2016). Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1% được dùng pha cao chiết và silymarin.
Chuột đực khỏe mạnh gồm 155 con cĩ khối lượng dao động từ 22 đến 25 g được chia thành 31 nhĩm, mỗi nhĩm gồm cĩ 5 con chuột. Trong đĩ, thử nghiệm gồm cĩ 4 nhĩm đối chứng và 27 nhĩm sử dụng cao chiết lần lượt ở các liều 100, 200 và 400 mg/kg khối lượng chuột. Chuột được cân khối lượng và bố trí vào các nhĩm thí nghiệm, chuột được uống thuốc vào buổi sáng (8-9 giờ) mỗi ngày, sau 1 giờ chuột
uống CCl4 sẽ được uống cao chiết hoặc silymarin với liều tương ứng mơ tả ở trên 1
lần/ ngày. Thí nghiệm được thực hiện trong thời gian 4 tuần. Các nhĩm chuột được bố trí thí nghiệm trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm bảo vệ gan của các cao chiết trên mơ hình chuột
Nhĩm Nội dung khảo sát
1 Chuột bình thường uống nước cất (đối chứng sinh lý)
2 Chuột bình thường uống dầu olive DMSO 1%
3 Chuột uống CCl4, (đối chứng bệnh)
4 Chuột uống CCl4, silymarin liều 16 mg/kg
5 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ lơng liều 100 mg/kg
6 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ lơng liều 200 mg/kg
7 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ lơng liều 400 mg/kg
8 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ leo liều 100 mg/kg
9 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ leo liều 200 mg/kg
10 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ leo liều 400 mg/kg
11 Chuột uống CCl4, cao lá Trang to liều 100 mg/kg
12 Chuột uống CCl4, cao lá Trang to liều 200 mg/kg
13 Chuột uống CCl4, cao lá Trang to liều 400 mg/kg
14 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo trắng liều 100 mg/kg
15 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo trắng liều 200 mg/kg
16 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo trắng liều 400 mg/kg
17 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo trắng liều 100 mg/kg
18 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo trắng liều 200 mg/kg
19 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo trắng liều 400 mg/kg
20 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo trắng 100 mg/kg
21 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo trắng 200 mg/kg
22 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo trắng 400 mg/kg
23 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo vàng 100 mg/kg
24 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo vàng 200 mg/kg
25 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo vàng 400 mg/kg
26 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo vàng 100 mg/kg
27 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo vàng 200 mg/kg
28 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo vàng 400 mg/kg
29 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo vàng 100 mg/kg
30 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo vàng 200 mg/kg
31 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo vàng 400 mg/kg
Sau thời gian 4 tuần, các nhĩm chuột được cân khối lượng, gây mê và giải phẫu lấy máu ở tim gởi đi xét nghiệm hàm lượng enzyme alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) bằng máy xét nghiệm sinh hĩa bán tự động Erba CHEM-7 (Phịng xét nghiệm 144, Đường Nguyễn An Ninh, Phường Tân An, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ).
Gan chuột ở các nghiệm thức được tách lấy quan sát và chụp ảnh. Sau đĩ gan được chia làm 2 phần, một phần để phân tích khả năng ức chế sự peroxide hĩa lipid
(thử nghiệm MDA) và điều hịa hoạt động kháng oxy hĩa (thử nghiệm GSH) trong gan chuột, phần cịn lại được cố định trong formol để thực hiện tiêu bản mơ bệnh học.
3.2.5.2 Khảo sát khả năng kháng oxy hĩa in vivo của các cao chiết
Định lượng malonyldialdehyd và glutathione
Tiến hành định lượng malonyldialdehyde (MDA) và glutathione (GSH) theo
phương pháp của Ohkawa et al. (1979) và Moron et al. (1979) được hiệu chỉnh theo
Nguyễn Bảo Trân và ctv (2011). Gan chuột được tách ra và nghiền đồng thể trong
dung dịch đệm KCl 1,15% ở nhiệt độ 4oC. Dịch đồng thể gan (1 mL) được trộn với 0,5
mL dung dịch đệm phosphate 25 mM (pH = 7,4) và ủ ở 37oC trong 60 phút. Phản ứng
sau khi được kết thúc bằng 0,5 mL acid tricloacetic 10% được ly tâm 13000 vịng/ phút trong 10 phút ở 4°C. Phần dịch lỏng sau khi ly tâm được sử dụng để xác định hàm lượng MDA và GSH.
Hàm lượng malonyldialdehyde (MDA) được xác định như sau: Lấy 1 mL dịch ly
tâm cho phản ứng với 0,5 mL acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 30 phút và đo độ
hấp thu quang phổ ở bước sĩng 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/g) được xác định dựa theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA.
Hàm lượng glutathione (GSH) được xác định như sau: 1 mL dịch ly tâm được phản ứng với 0,2 mL thuốc thử Ellman và 1,8 mL dung dịch đệm EDTA-phosphate. Hỗn hợp phản ứng được để yên 3 phút ở nhiệt độ phịng và sau đĩ tiến hành đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 412 nm. Hàm lượng GSH (nM/g) được xác định dựa theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH.
3.2.5.3 Khảo sát khả năng bảo vệ mơ gan của các cao chiết
Thực hiện tiêu bản mơ bệnh học gan chuột
Tiêu bản mơ học gan chuột thí nghiệm được thực hiện dựa theo qui trình được
mơ tả bởi Saalu et al. (2012) cĩ hiệu chỉnh. Gan ở các nhĩm chuột sau khi tách lấy
được cố định trong dung dịch formol 2% và 4%. Các mẫu gan đã cố định ở các nhĩm
chuột thí nghiệm được rửa với nước và được khử nước ở các nồng độ cồn 50o, 70o,
80o, 90o, 96o. Các mẫu gan tiếp tục được ngâm trong xylen, paraffin, sáp ong (ủ trong 24 giờ) và đúc khuơn trong parafin. Sau đĩ, các mẫu gan được cắt thành lát cĩ độ dày khoảng 5 µm, dán mẫu lên lame đã tráng glycerin trộn với lịng trắng trứng và để khơ tự nhiên. Nhuộm mẫu với hematoxylin 10%, eosin Y 0,1% và mẫu được làm trong bởi xylen. Tiêu bản được đậy và dán với Baume Canada. Tiêu bản mơ bệnh học gan chuột sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học để phân tích đánh giá mức độ tổn thương và phục hồi của mơ gan.