- E.coli: Khuẩn lạc to (đƣờng kính 3÷5 mm) màu xám, ẩm và có dạng lồi 2.4.7 Phương pháp định loại một số vi khuẩn
2.4.10. Xác định tồn dư kháng sinh trong sữa bằng phương pháp vi sinh vật
(theo quy trình của Bộ mơn Vệ sinh thú y – Viện Thú y) 2.4.10.1. Cơ chế
Phát hiện kháng sinh trong sữa bằng phƣơng pháp vi sinh vật dựa trên nguyên lý kháng sinh trong mẫu sữa sẽ khuyếch tán ra môi trƣờng thạch đã trộn nha bào của vi khuẩn mẫn cảm, tuỳ theo mức độ khuếch tán sẽ tạo thành vùng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Độ rộng vùng ức chế vi khuẩn đánh giá mức độ tồn dƣ kháng sinh trong mẫu.
2.4.10.2. Cách tiến hành và đọc kết quả
Trong thí nghiệm này sử dụng 2 loại vi khuẩn mẫn cảm kháng sinh là
Bacillus subtilis B.G.A và B. stearothermophilus var Calidelactie C - 953.
Hai loại vi khuẩn trên đƣợc đóng khơng trong ống thuỷ tinh, khi tiến hành thí nghiệm mở bằng cách cắt vô trùng ống thuỷ tinh, thêm 0,2 - 0,5ml nƣớc thịt hoặc dung dịch BHI, để dễ hoà tan vi khuẩn. Bơm dung dịch trên vào nƣớc thịt
nuôi cấy trong tủ ấm ở 370C với B. subtilis B.G.A và 560C với B.
stearothermophilus C - 953 trong 24 - 48h. Cấy canh trùng trên thạch BHI, sau
đó ni cấy ở nhiệt độ nhƣ đã nêu ở trên, sau đó kích hoạt qua nƣớc thịt mới trong 24 giờ.
Để thu hoạch đƣợc lƣợng nha bào lớn có thể dùng theo hai cách: * Nuôi cấy vi khuẩn trên mặt thạch BHI trong bình Roux, ngày đầu tiên ni trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp với từng giống vi khuẩn đã nêu trên, những ngày sau nuôi ở nhiệt độ phịng, thời gian ni khoảng 12 ÷ 14 ngày. Thu hoạch nha bào bằng cách rửa mặt thạch bằng dung dịch PBS hoặc nƣớc sinh lý.
* Ni cấy trong bình tam giác với nƣớc Pepton, ngày đầu tiên nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp với từng giống vi khuẩn đã nêu trên, những ngày sau nuôi ở nhiệt độ phịng, thời gian ni khoảng từ 18 ÷ 20 ngày, hàng ngày lắc nhẹ bình. Nha bào thu hoạch đƣợc rửa 3 lần bằng PBS hoặc dung dịch sinh lý bằng cách ly tâm 3500v/phút, trong 15 phút, pha lỗng đến nồng độ 10 7 ÷ 108 nha bào/1ml đó là dung dịch nha bào chuẩn.
Cách thu hoạch nha bào trong bình Roux thuận tiện khi xử lý số lƣợng mẫu nhiều trong cùng 1 đợt. Ngƣợc lại cách thu hoạch nha bào từ bình tam giác với mơi trƣờng lỏng thuận tiện cho lƣợng mẫu ít, nhƣng phải xử lý kéo dài trong một số ngày bằng cách lấy vơ trùng lƣợng canh khuẩn cần dùng, số cịn lại để ở nhiệt độ phòng vẫn đảm bảo chất lƣợng trong 7 ÷ 10 ngày tiếp theo.
2.4.10.3. Chuẩn bị đĩa thạch Đƣờng kính vùng ức chế vi khuẩn bao gồm cả đƣờng kính lỗ đục 1cm
Mơi trƣờng thạch Muller Hinton đã hấp 1210C/15 phút Dùng đĩa lồng Petri φ - 90mm
Đổ 15ml thạch vào 1 đĩa, để nguội
Chuẩn độ thạch theo 3 độ pH: 6; 7,2; 8. Riêng thạch có pH = 7,2 trộn thêm dung dịch trimethoprim 50mg/1ml với tỷ lệ 1% trong thạch.
Khi thạch nguội đến 50 ÷ 550C trộn vào mỗi loại mơi trƣờng một lƣợng dung dịch nha bào nhƣ trên đã chuẩn bị theo tỷ lệ 1:10 trộn đều và đổ lớp thạch thứ 2 này lên trên các đĩa có 1 lớp thạch, 10ml/1 đĩa. Sau khi lớp thạch thứ 2 đã nguội, dùng dụng cụ đục lỗ vô trùng đục lỗ trên mặt thạch theo sơ đồ. Nếu chƣa sử dụng, các đĩa thạch chƣa đục lỗ phải bảo quản ở 40C trong thời gian 1 tuần.
2.4.10.4. Pha kháng sinh chuẩn
* Pha penicillin: Cần pha dung dịch chuẩn có 1UI/1ml (62mg penicillin tƣơng ứng 1000 000 UI).
Pha dung dịch đậm đặc (Stock) 0,31mg trong 100 ml nƣớc có độ pH = 6, bảo quản ở 40 - 60C đƣợc 2 tuần.
Khi sử dụng lấy 1ml dung dịch đậm đặc pha thành 50ml dung dịch chuẩn. * Pha streptomycin: cần pha dung dịch chuẩn 0,5 mg/ml. Dung dịch đậm đặc có 5mg trong 100ml nƣớc cất, bảo quản 4 - 60C đƣợc vài tuần.
Khi sử dụng pha loãng dung dịch 1% trong nƣớc cất.
* Pha dung dịch trimethoprim: 1mg/1ml ethanol khuấy đều, thêm 19ml nƣớc cất đƣợc dung dịch chuẩn 50mg/ml.
* Pha dung dịch sulfadiazin: cần pha dung dịch chuẩn 2mg/ml.
Dung dịch đậm đặc gồm 5mg trong 10ml nƣớc cất, bảo quản ở 4 ÷ 60C đƣợc vài tuần. Khi sử dụng pha loãng theo tỷ lệ 2% với nƣớc cất.
2.4.10.5. Chuẩn bị mẫu sữa
Mẫu sữa bảo quản lạnh hoặc đƣợc làm tan đơng, ly tâm 3000 vịng/phút trong 15 phút để tách kem. Phần sữa đƣợc tách kem đƣợc đặt trong nồi cách thuỷ 800C trong 5 phút.
2.4.10.6. Xét nghiệm mẫu và đọc kết quả
Chuyển vào ô trung tâm đĩa thạch nuôi B. stearothermophilus C - 953 và đĩa ni B. subtilis B.G.A có pH = 6: 100µl dung dịch pencillin chuẩn.
Chuyển vào ơ trung tâm đĩa thạch ni B. subtilis B.G.A có pH = 8; 100µl dung dịch streptomycin chuẩn sunfadiazin chuẩn. Chuyển vào ô trung tâm đĩa thạch nuôi B. subtilis B.G.A có pH = 8: 100µl dung dịch chuẩn streptomycin chuẩn.
Chuyển 100µl mẫu đã chuẩn bị vào các ơ cịn lại và ghi rõ ký hiệu.
Chuyển các đĩa nuôi B. subtilis B.G.A vào ủ trong tủ ấm 370C và đĩa nuôi
B. stearothermophilus C - 953 ủ ở nhiệt độ 560C trong 24h.
Đọc kết quả: Có hai cách đọc kết quả dựa vào phƣơng pháp đo vùng ức chế vi khuẩn.
* Cách 1: Đo từ biên đƣờng tâm tròn giống đến biên đƣờng tròn ức chế vi khuẩn. Kết quả dƣơng tính khi kích thƣớc lớn hơn hoặc bằng 2mm là dƣơng tính, lớn hơn và nhỏ hơn 2mm là nghi ngờ.
* Cách 2: Đo đƣờng kính ức chế vi khuẩn bao gồm cả đƣờng kính giống ( φ giống = 8mm). Đƣờng kính này lớn hơn hoặc bằng 12mm là dƣơng tính, lớn hơn 8mm và nhỏ hơn 12mm là nghi ngờ.