4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
2.2.Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ năm 2006 đến năm 2011, tại:
- Bộ môn Sinh lý, Sinh sản và Tập tính vật nuôi - Viện Chăn nuôi.
- Khoa Thú y - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Trạm kiểm nghiệm và bảo tồn vật nuôi - Viện Chăn nuôi.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của áp lực hút
* Ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng nang trứng được hút và tế bào trứng thu được
Để đánh giá sự ảnh hưởng của áp lực hút, 72 lượt buồng trứng của bò sống được siêu âm hút tế bào trứng. Tổng số nang trứng được hút (Bảng 3.1) ở áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng: 167, 172, 170 và 178 nang. Tổng số tế bào trứng thu được từ các nang trứng ở áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng 54, 75, 138 và 155 tế bào trứng.
Bảng 3.1. Số lượng nang trứng được hút và ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng tế bào trứng thu được
Áp lực hút
Nang trứng được hút Tế bào trứng thu được
% n X ± SE n X ± SE 60 mmHg 167 9,28a ± 0,52 54 3,00a ± 0,27 32,34 90 mmHg 172 9,56a ± 0,57 75 4,17b ± 0,35 43,60 120 mmHg 170 9,44a ± 0,39 138 7,67c ± 0,31 81,18 150 mmHg 178 9,89a ± 0,52 155 8,61c ± 0,44 87,08
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác có ý nghĩa P < 0,05%; %: Tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút; X: Bình quân/buồng trứng/lần
Từ kết quả nang trứng được hút cho thấy, số lượng nang trứng được hút/buồng trứng/lần không có sự khác nhau (P < 0,05) vào thời điểm siêu âm
hút tế bào trứng ở các mức độ áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng: 9,28; 9,56; 9,44 và 9,89 nang. Song lại có sự ảnh hưởng rõ rệt của áp lực hút đến kết quả tế bào trứng thu được (P < 0,05), có sự sai khác biệt giữa áp lực 120 và 150 mmHg so với áp lực 60 và 90 mmHg, tương ứng: 7,67 và 8,61 tế bào trứng/buồng trứng/lần so với 3,00 và 4,17 tế bào trứng/buồng trứng/lần (P < 0,05). Nhưng căn cứ vào số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần siêu âm hút tế bào trứng cho thấy ở áp lực hút 150 mmHg cao nhất.
Qua số lượng tế bào trứng thu được/nang trứng được hút, có thể thấy rằng số lượng nang trứng được hút không có sự khác nhau (p < 0,05), tuy nhiên tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút lại có sự chênh lệch giữa các mức độ áp lực hút, tương ứng: 32,34% ở 60 mmHg, 43,60% ở 90 mmHg, 81,18% ở 120 mmHg và 87,08% ở 150 mmHg. Như vậy có thể thấy rằng khi tăng áp lực hút thì số lượng tế bào trứng thu được cũng như tỉ lệ tế bào trứng thu được tăng lên. Tỉ lệ tế bào trứng thu được ở áp lực hút 60 và 90 mmHg của chúng tôi thấp hơn nhiều so với kết quả của Nguyễn Văn Lý và cs. (2006), song ở áp hút 120 và 150 mmHg lại tương đối phù hợp với tác giả, khi tác giả thu tế bào trứng bằng phương pháp hút dịch nang trứng và phương pháp phẫu thuật thu được tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng có kích thước ≤ 8 mm là 82,38%. Như vậy, có thể nói, quá trình siêu âm hút tế bào trứng là một quá trình phức tạp, bao gồm rất nhiều yếu tố và bị hạn chế bởi khả năng quan sát so với thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ, tỉ lệ tế bào trứng thu được ở áp suất thích hợp cho kết quả tốt.
Kết quả thu được cho thấy, ở áp lực hút thấp số lượng tế bào trứng thu được thấp. Nguyên nhân có thể do ở lực hút yếu nên dịch nang trứng cùng với các tế bào trong dịch nang trứng không được hút ra hết. Mặt khác ở những nang trứng lớn do lực hút chậm nên có thể đã có một số lượng dịch nang
trứng bị thoát ra xung quanh vết kim đâm. Số lượng tế bào trứng tăng lên khi áp lực hút tăng cao là do lực hút mạnh đã hút được tối đa dịch nang trứng và lực tác động cơ học lên sự liên kết giữa tế bào trứng và các tế bào xung quanh. Nhưng số lượng tế bào trứng thu được tăng lên có làm ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng, đặc biệt là màng cumulus cần được nghiên cứu để tìm ra áp lực hút đảm bảo cho quá trình tạo phôi in vitro vì khả năng phát triển cao nhất của tế bào trứng khi có hình thái tròn trịa, tế bào chất đồng nhất và phải có từ 3 lớp màng cumulus trở lên (Rita và cs., 2003).
* Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng
Đánh giá chất lượng tế bào trứng là khâu quan trọng để đạt được kết quả cao trong quá trình nuôi thành thục, thụ tinh in vitro, liên quan mật thiết đến kết quả hợp tử phân chia, số lượng phôi dâu và phôi nang thu được. Đánh giá chất lượng tế bào trứng được thực hiện trên màn hình của kích hiển vi soi nổi, dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, đặc biệt là đặc điểm và số lượng màng cumulus (Hình 3.1) để phân loại chất lượng tế bào trứng theo bốn mức độ từ tốt đến xấu A, B, C và D. Kết quả nghiên cứu và thực tiễn cho thấy, chỉ có tế bào trứng có chất lượng loại A và B mới có khả năng phát triển tốt.
Kết quả thu được cho thấy, có sự ảnh hưởng của áp lực hút lên chất lượng tế bào trứng loại A (P < 0,05). Bình quân tế bào trứng loại A ở các mức độ áp lực 60, 90, 120 và 150 mmHg, tương ứng 1,44; 1,89; 3,78 và 2,44 tế bào trứng/buồng trứng/lần (Bảng 3.2). Như vậy, tế bào trứng loại A/buồng trứng/lần thấp nhất ở áp lực 60 mmHg và cao nhất ở áp lực hút 120 mmHg.
Có sự khác biệt (P < 0,05) về số lượng tế bào trứng loại B/buồng trứng/lần ở áp lực 60 mmHg và 90 mmHg so với 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng: 1,06 và 1,33 tế bào trứng so với 3,00 và 3,17 tế bào trứng. Ở áp lực 150 mmHg cho kết quả tế bào trứng loại B/buồng trứng/lần cao nhất và thấp nhất ở áp lực hút 60 mmHg (P < 0,05).
Có sự sai khác (P < 0,05) về số lượng tế bào trứng loại C/buồng trứng/lần ở áp lực 150 mmHg so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg, tương ứng: 1,44 tế bào trứng so với 0,33; 0,56 và 0,56 tế bào trứng. Tương tự, tế bào trứng loại D ở áp lực hút 150 mmHg có sự khác biệt với áp lực hút 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg (P < 0,05). Bình quân số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần loại D ở áp lực 150 mmHg (1,56 tế bào), cao hơn so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg (tương ứng: 0,17; 0,39 và 0,33 tế bào trứng).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng
Áp lực Hút Chất lượng tế bào trứng A B C D X ± SE (n) X ± SE (n) X ± SE (n) X ± SE (n) 60 mmHg 1,44a ± 0,17 (26) 1,06a ± 0,17 (19) 0,33a ± 0,14 (6) 0,17a ± 0,09 (3) 90 mmHg 1,89b ± 0,16 (34) 1,33a ± 0,20 (24) 0,56a ± 0,17 (10) 0,39a ± 0,12 (7) 120 mmHg 3,78c ± 0,27 (68) 3,00b ± 0,26 (54) 0,56a ± 0,15 (10) 0,33a ± 0,11 (6) 150 mmHg 2,44b ± 0,23 (44) 3,17b ± 0,27 (57) 1,44b ± 0,20 (26) 1,56b ± 0,18 (28)
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác có ý nghĩa P < 0,05; A, B, C và D: Chất lượng tế bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp; X: Bình quân/buồng trứng/lần
Như vậy có thể nói rằng áp lực đã ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng. Sự ảnh hưởng này liên quan mật thiết đến kết quả nuôi thành thục và tạo phôi in vitro. Nguyễn Văn Lý và cs. (2006); Nguyễn Hữu Đức và cs. (2003) đã tiến hành nghiên cứu và có kết luận rằng, chất lượng tế bào trứng trước khi nuôi ảnh hưởng đến tỉ lệ trứng thành thục. Số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần có chất lượng C và D cao là một kết quả không mong
muốn khi siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm. Tế bào trứng loại A, B thường được sử dụng, do có tỉ lệ thành thục, thụ tinh và tạo phôi trong ống nghiệm cao, còn chất lượng tế bào trứng loại C và D thường không được sử dụng để nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi trong ống nghiệm do kết quả thu được rất kém (Shiora và cs., 1988). Nguyễn Văn lý và cs. (2006) cũng có kết luận tương tự khi ông nghiên cứu ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng đến khả năng thành thục từ tế bào trứng được thu từ buồng trứng của lò mổ thấy rằng, không có sự sai khác ý nghĩa về tỉ lệ thành thục giữa tế bào trứng loại A và tế bào trứng loại B (71,19% và 69,46%; P < 0,05), nhưng tỉ lệ thành thục của tế bào trứng loại C lại thấp hơn nhiều so với loại A và B, chỉ đạt (38,35%; P < 0,05).
Tế bào trứng loại A Tế bào trứng loại B
Tế bào trứng loại C Tế bào trứng loại D (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả của chúng tôi thu được ở áp suất 60 mmHg tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Lý và cs. (2006) về tế bào trứng loại A và B/buồng trứng/lần, khi ông tiến hành nghiên cứu siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống, số lượng tế bào trứng loại A và B thu được/buồng trứng/lần siêu âm, tương ứng 1,44 và 0,97 tế bào trứng. Tuy nhiên, ở áp lực hút 90, 120 và 150 mmHg của chúng tôi lại cao hơn.
* Ảnh hưởng của áp lực hút đến hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được
Tế bào trứng loại A và B được nuôi thành thục, thụ tinh, nuôi hợp tử và phôi in vitro đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Kết quả thu được cho thấy, có sự sai khác về số lượng hợp tử phân chia (Bảng 3.3) ở áp lực hút 120 mmHg, 150 mmHg so với 60 và 90 mmHg (P < 0,05), tương ứng 3,61; 2,50 so với 1,50 và 1,72 hợp tử/buồng trứng/lần. Số lượng hợp tử/tế bào trứng nuôi thành thục cao nhất ở áp lực 60 mmHg (60%) so với áp lực 90 (53,45%), 120 mmHg (53,28%) và 150 mmHg (44,55%). Như vậy, tỉ lệ hợp tử thu được ở áp lực 60 mmHg tốt nhất. Kết quả này cho thấy rằng, ở áp lực này sự ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng ít hơn so với các mức độ áp lực khác. Tuy nhiên ở áp lực này số lượng tế bào trứng thu được là rất thấp, do vậy số lượng hợp tử thu được/buồng trứng/lần rất thấp, chỉ đạt 1,50 hợp tử. Trong khi đó tỉ lệ hợp tử phân chia ở áp lực hút 120 mmHg có phần thấp hơn áp lực 60 mmHg, nhưng số lượng hợp tử thu được/buồng trứng/lần lại cao nhất (3,61 hợp tử; P < 0,05).
Hợp tử sau khi phân chia được tiếp tục nuôi đến giai đoạn phôi nang và phôi dâu. Qua số lượng phôi dâu và phôi nang thu được cho thấy, (Bảng 3.3) không có sự ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng phôi dâu và phôi nang thu được (P < 0,05). Song căn cứ vào số lượng phôi thu được/buồng trứng/lần thì ở áp lực hút 120 mmHg (1,11 phôi) cao hơn so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 150 mmHg (tương ứng: 0,56; 0,61 và 0,67 phôi/buồng trứng/lần).
Tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được ở các mức độ áp lực 60. 90, 120 và 150 mmHg tương ứng: 22,22; 18,97; 16,39 và 11,88 %. Từ kết quả thu được cho thấy, ở áp lực hút càng cao khả năng thu được tế bào trứng càng lớn, song tỉ lệ hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được đã bị giảm xuống. Dựa vào mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra áp lực hút thích hợp cho số lượng phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất ta thấy ở áp lực hút 120 mmHg đáp ứng được điều đó, với 1,11 phôi/buồng trứng/lần siêu âm, cao hơn các mức độ áp suất còn lại (P < 0,05).
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của áp lực hút đến sự phân chia của hợp tử, phôi dâu và phôi nang
Áp lực hút Tế bào trứng
nuôi in vitro (n)
Hợp tử phân chia Phôi dâu và phôi nang
X ± SE (n) % X ± SE (n) %
60 mmHg 45 1,50a ± 0,23 (27) 60,00 0,56a ± 0,17 (10) 22,22 90 mmHg 58 1,72a ± 0,21 (31) 53,45 0,61a ± 0,14 (11) 18,97 120 mmHg 122 3,61b ± 0,31 (65) 53,28 1,11a ± 0,20 (20) 16,39 150 mmHg 101 2,50c ± 0,23 (45) 44,55 0,67a ± 0,14 (12) 11,88
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác có ý nghĩa P < 0,05; %: Tỉ lệ hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu được/tế bào trứng nuôi in vitro; X: Bình quân/buồng trứng/lần
* Kết luận
Qua kết quả nghiên cứu ta thấy có sự biến động rất lớn về số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được (P < 0,05). Số lượng tế bào trứng ở áp lực hút 150 mmHg cao nhất (8,61 tế bào trứng/buồng trứng/lần). Chất lượng tế bào trứng loại A, B ở áp lực hút 120 mmHg cao nhất (3,78 và 3,00 tế bào trứng/buồng trứng/lần). Số
lượng hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất ở tần suất 120 mmHG (1,11 phôi/buồng trứng/lần). Từ kết quả nghiên cứu này có thể đưa ra kết luận rằng, áp lực hút 120 mmHg là tốt nhất.
Hình 3.2. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 4 mức độ áp suất
khác nhau
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với tác giả Hashimito và cs. (1998); Jaskowski. (2001); Kruip và cs. (1994); Pawel và cs. (2007) khi các tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút khi siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống kết luận rằng, áp lực hút ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế bào trứng. Tương tự Pawel và cs. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút lên số lượng và chất lượng tế bào trứng ở lợn và bò đi đến kết luận rằng, áp lực hút tế bào trứng ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng (P < 0,05). Nghiên cứu của Bols và cs. (1996) về sự ảnh hưởng của áp lực hút lên số lượng tế bào trứng thu được cũng cho thấy, số lượng tế bào trứng thu được tăng lên khi sử dụng áp lực hút > 130 mmHg so với 50 mmHg, 70 mmHg, 90 mmHg và 110 mmHg.
Nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu thấy rằng, mức độ áp lực hút sử dụng trong quá trình siêu âm hút tế bào trứng có sự liên quan mật thiết với số lượng tế bào trứng được hút ra cũng như chất lượng tế bào trứng (Bols và cs., 1996; Jaskowski, 2001; Kruip và cs., 1994; Pawel và cs., 2007). Theo các lập luận của các nhà khoa học trong quá trình siêu âm hút tế bào trứng, các tế bào trứng có thể bị ảnh hưởng của áp lực hút, tốc độ, dòng xoáy, khi tăng áp suất lên cao làm giảm khả chất lượng tế bào trứng và làm tăng tỉ lệ tế bào trứng bị lột trần (không có màng cumulus). Lập luận của các tác giả cũng phù hợp với giả thuyết và kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Bols và cs. (1996) cũng cho rằng, độ chính xác của áp lực hút phụ thuộc vào cấu tạo của thiết bị siêu âm hút tế bào trứng, đường kính của kim hút tế bào trứng, độ dài và kích thước của ống dẫn dịch. Rõ ràng áp lực hút đóng một vai trò quan trọng khi siêu âm hút tế bào trứng và thụ tinh ống nghiệm, kết quả sau cũng cho thấy các tác giả có kết quả khác nhau khi sử dụng áp lực hút khác nhau: Moreno (1993) sử dụng áp suất 120 mmHg (kim 18 G), Gibbons. (1994) sử dụng 75 mmHg (kim 17 G), Manjunatha (2008) sử dụng 110 mmHg (kim 18 G).
Khi siêu âm hút tế bào trứng, số lượng tế bào trứng thu được cao hay thấp còn phụ thuộc vào kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng. Để xác định chính xác số lượng, kích thước nang trứng, thu được hết số lượng tế bào trứng, việc cố định và di chuyển buồng trứng là một trong những yếu tố rất quan trọng để có hình ảnh sắc nét của các nang trứng trên màn hình máy siêu âm. Kỹ thuật