4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
1.6.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi thành thục tế bào
Báo cáo về nuôi thành thục tế bào trứng in vitro của các nhà khoa học cho thấy thấy, khả năng phát triển của các tế bào trứng giảm sau khi nuôi in vitro. Tuy nhiên, chất lượng tế bào trứng tốt kết hợp với cải tiến được điều kiện và chất lượng môi trường nuôi có thể nâng cao được khả năng phát triển của tế bào trứng khi bổ sung các thành phần quan trọng như: Bổ sung huyết thanh, hormone và các chất bổ sung khác (Gordon và Lu, 1990).
1.6.2.1. Chất lượng tế bào trứng
Chất lượng tế bào trứng đóng vai trò quan trọng đến sự thành thục, thụ tinh và sự phát triển của phôi, vì vậy được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, hầu hết các nhà khoa học đều đánh giá chất lượng tế bào trứng trên kinh hiển vi soi nổi, dựa vào đặc điểm, hình thái như kích
thước tế bào trứng, hình dạng, màu sắc, vòng trong suốt và màng cumulus. De Loos và cs. (1989) đánh giá chất lượng tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi, dựa vào sự chặt chẽ và sự trong suốt của màng cumulus bao quanh tế bào trứng. Sự đồng nhất và trong suốt của của khối tế bào chất với 4 cấp độ từ tốt đến xấu: 1) Có nhiều lớp màng cumulus chặt chẽ, tế bào chất đồng nhất, khối tế bào cumulus sáng và trong suốt; 2) Có nhiều lớp tế bào cumulus chặt chẽ, tế bào chất đồng nhất nhưng có những vùng tối phía ngoài tế bào trứng, khối tế bào cumulus ít sáng và ít trong suốt hơn loại 1; 3) Có ít lớp cumulus bao quanh tế bào trứng hơn loại 1, khối tế bào chất không đều, có các đám đen và khối tế bào cumulus tối hơn loại 1 và loại 2; 4) Không có hoặc các lớp cumulus giãn nở, các tế bào cumulus tụ tập lại thành từng đám tối, khối tế bào cumulus tối và không đều.
Goodhand và cs. (1999) đánh giá chất lượng tế bào trứng theo 4 mức độ A, B, C và D khác nhau dựa vào hình dạng, sự đồng nhất của tế bào chất và đặc biệt là màng cumulus. A) có 4 lớp màng cumulus trở lên, phân bố rõ ràng, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất; B) có 1 lớp màng tế bào cumulus trở lên, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất; C) một số phần cumulus bị lột trần, tế bào chất co lại không đều; D) tế bào trứng hoàn toàn bị lột trần và tế bào chất co lại không đều.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng lên khả năng phát triển (Sylvie Bilodeau-Goeseels và Paul Panich, 2001) đã phân chia chất lượng tế bào trứng thành 6 loại, dựa vào đặc điểm của các lớp màng cumulus và đặc điểm của khối tế bào chất. Kết quả cho thấy, không có sự khác nhau đáng kể về tỉ lệ phân chia và phôi nang thu được ở tế bào trứng có chất lượng loại I và loại II, tương ứng 13,9 và 13,7 %. Song có sự khác nhau giữa tế bào trứng chất lượng loại I và II so với các nhóm còn lại và thấp nhất là nhóm V và nhóm VI chỉ đạt 0,3 và 1,9 % (Bảng 1.2).
Younis và cs. (1989) đánh giá chất lượng tế bào trứng thành hai loại, dựa vào tế bào chất và màng cumulus. Tế bào trứng được sử dụng nuôi cấy (loại 1) là tế bào trứng đồng nhất, các tế bào cumulus chặt chẽ và gắn chặt với màng trong suốt. Tế bào trứng không được sử dụng (loại 2) là tế bào có tế bào cumulus không chặt chẽ, trứng không đồng nhất.
Bảng 1.4. Đánh giá chất lượng tế bào trứng ở 6 mức độ khác nhau
Loại Số lượng màng cumulus
Đặc điểm của các lớp màng cumulus
Đặc điểm của khối tế bào chất
I ≥ 5 Liên kết với nhau chặt chẽ Đồng nhất
II ≥ 5 Hơi giãn nở Hơi kết thành từng đám
III < 5 Chặt chẽ hoặc hơi giãn nở Đồng nhất
IV < 5 Chặt chẽ hoặc hơi giãn nở Kết thành từng đám
V 0 Không có màng cumulus Biến đổi
VI ≥ Giãn nở, từng đám đen tụ lại Kết thành rất nhiều đám
(Nguồn Sylvie Bilodeau-Goeseels và Paul Panich, 2001)
Ảnh hưởng chất lượng hình thái học của tế bào trứng chưa thành thục cũng được Khurana và Niemann. (2000) nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng, chất lượng hình thái học của tế bào trứng ảnh hưởng đến khả năng thành thục khi nuôi in vitro, thụ tinh, phân chia và phôi dâu và phôi nang thu được. Với tế bào trứng loại 1 (loại tốt nhất) tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất 33,9%, trong khi đó loại 2 là 13,1%, còn loại 3 và loại 4 không thu được.
1.6.2.2. Màng cumulus
Cumulus có rất nhiều chức năng quan trọng trong quá trình phát triển và thụ tinh của tế bào trứng. Bảo vệ tế bào trứng dưới sự tác động của quá trình tự thoái hóa của nang trứng (meiotic arrest), tham gia vào quá trình khôi phục quá trình phân bào giảm nhiễm, hỗ trợ sự thành thục của tế bào chất, thu
hút và bẫy hay lựa chọn tinh trùng, tạo thuận lợi cho tinh trùng thâm nhập vào trong tế bào trứng, ngăn cản sự chai cứng sớm của vòng trong suốt.
Phương pháp đầu tiên quan sát để xác định có hay không có khả năng phát triển của tế bào trứng đó là hình thái học của cumulus. Các tế bào cumulus có nguồn gốc của các tế bào hạt buồng trứng có chức năng riêng biệt. Tầm quan trọng của tế bào cumulus là cung cấp dinh dưỡng cho tế bào trứng trong quá trình phát triển, tham gia hình thành vòng trong suốt và sóng LH, tổng hợp các thành phần protein tử cung và axít hyaluronic cần thiết cho sự vận chuyển và bẫy tinh trùng (Bedford và Kim, 1993). Các tế bào cumulus hình thành lên vành phóng xạ, là màng gần nhất với tế bào trứng và thông thường có sự tiếp xúc chặt chẽ, sử dụng sự giãn nở của tế bào chất qua vòng trong suốt và phía ngoài của cumulus liên kết với vành phóng xạ qua khe liên kết (Gap junction hay khe kết là một loại gian bào đặc biệt liên kết giữa các loại tế bào với nhau. Liên kết trực tiếp tế bào chất với 2 tế bào với nhau và cho phép các phân tử tự do qua lại giữa các tế bào (De Loose, 1991). Độ dày của màng cumulus thay đổi phụ thuộc vào kích thước nang trứng. Sự nguyên vẹn của tế bào cumulus cũng thay đổi qua tình trạng sức khỏe của nang trứng (Leibfried và First, 1979). Trong thời gian nang trứng thoái hóa phía ngoài cumulus ít chặt chẽ vì phần giữa các tế bào cả ở bên trong và bên ngoài cumulus giảm (Leibfried và First, 1979; De Loos và cs., 1989). Một số nghiên cứu đã đánh giá mức độ chặt chẽ hình thái cumulus sau khi phát triển (Younis và cs., 1989; Gordon và Lu, 1990; De Loos và cs., 1991; Lonergan, 1992). Khi tế bào trứng chưa trưởng thành được phân loại dựa vào số lượng màng cumulus bao quanh tế bào trứng sau khi hút ra, cumulus có độ dày nhiều hơn cho sự phát triển tốt hơn (Lonergan, 1992). Số lượng màng cumulus giảm có thể do quá trình hút tế bào trứng và cũng có thể giảm số lượng màng cumulus do quá trình thoái hóa sớm của nang trứng. Có một mối quan hệ quan sát
được giữa sự thoái hóa của cumulus và sự thoái hóa của nang trứng (Blondin và Sirard, 1995). Có nhiều cumulus chặt chẽ là nguồn gốc nang trứng khỏe hơn so với nang trứng thoái hóa. Sự có mặt của tế bào cumulus trong thời gian thành thục là cần thiết cho hầu hết các tế bào trứng để tăng nhanh khả năng phát triển (Sirard và cs., 1988).
Ở bò tác động làm giảm màng cumulus trước khi nuôi chín in vitro làm ảnh hưởng đến khả năng thành thục của tế nào trứng (Fukui và Sakuma, 1980). Các tế bào trứng không có màng cumulus không có khả năng thụ tinh (Van Soom và cs., 2002). Các tế bào cumulus đóng vai trò quan trọng trong sự thành thục của tế bào trứng: Kìm hãm quá trình giảm phân của tế bào trứng, hồi phục của quá trình giảm phân và hỗ trợ sự trưởng thành của tế bào chất.
1.6.2.3. Tế bào chất
Bên cạnh màng cumulus, chất lượng của tế bào chất cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ phát triển của tế bào trứng, sự phát triển của hợp tử đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang (Goovaerts và cs., 2010). Sự đồng nhất được đánh giá dưới kính hiển vi soi nổi, là phương pháp phổ biến nhất để phân loại chất lượng tế bào trứng (Bảng 1.3).
Ngoài ra, một số tác giả đã sử dụng phương pháp nhuộm Brilliant Cresyl Blue (Rodriguez-Gonzalez và cs., 2002; Manjunatha và cs., 2008) để đánh giá sự phát triển của của tế bào chất. Nhuộm Brilliant Cresyl Blue không làm tổn thương đến tế bào. Cơ sở để đánh giá là dựa vào mức độ hoạt động của G6PDH (Glucose-6-phosphate-Dehydrogenase). G6PDH là protein được tổng hợp trong tế bào trứng chưa thành thục, làm đổi màu của Brilliant Cresyl Blue thành chất không màu. G6PDH là một enzym chứa đường đơn đóng vai trò cung cấp năng lượng cho tế bào, đặc biệt là hoạt động trong sự phát triển của tế bào trứng và giảm hoàn toàn hoạt động này khi tế bào trứng kết thúc
giai đoạn phát triển. Khi G6PDH hoạt động thuốc nhuộm Brilliant Cresyl Blue bị giảm màu, do đó có thể xác định được hoạt động bên trong tế bào của G6PDH. Các tế bào trứng đã thành thục hoàn toàn hoạt động của G6PDH giảm, tế bào chất được nhuộm Brilliant Cresyl Blue sẽ có màu xanh và khi các tế bào trứng đang ở giai đoạn phát triển tế bào chất được nhuộm Brilliant Cresyl Blue sẽ không có màu. Kết quả nghiên cứu của các tác giả cho thấy, các tế bào trứng xuất hiện màu xanh có kích thước tế bào trứng lớn hơn, khả năng phát triển tốt hơn, sau khi nuôi thành thục tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn metapha II cao hơn và tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn phôi nang sau khi thụ tinh cao hơn.
Ảnh hưởng của khối tế bào chất lên chất lượng tế bào trứng và khả năng phát triển cũng được quan tâm nghiên cứu (Nagano và cs., 2007). Kết quả nghiên cứu cho thấy chất lượng bên trong của tế bào trứng là yếu tố chìa khóa để xác định khả năng phát triển đến giai đoạn phôi nang. Một thay đổi nhỏ về siêu cấu trúc xảy ra khi tế bào trứng phát triển đều có sự liên quan chặt chẽ với khả năng phát triển. Sự liên quan giữa khả năng phát triển của tế bào trứng và vi cấu trúc của khối tế bào chất đặc điểm dưới kính hiển vi thành 7 nhóm khác nhau (Bảng 1.3)
Bảng 1.5. Mối quan hệ giữa đặc điểm tế bào chất và chất lượng tế bào trứng
Nhóm tế bào trứng
Các đặc điểm của tế bào chất Khả năng phát triển
1 Màu nâu và đồng nhất Tốt
2 Màu nâu và đồng nhất, có màu đen ở khu vực ngoài Tốt
3 Màu nâu và đồng nhất, có các đám đen Tốt
4 Nhợt nhạt và đồng nhất Kém
5 Nhợt nhạt và đồng nhất, có các đám đen Kém
6 Đen và đồng nhất Kém
Tế bào chất đóng vai trò quan trọng trong khả năng sinh sản của tế bào mầm, điều tiết quá trình giảm phân và cũng là yếu tố làm rối loạn quá trình sinh sản. Tế bào trứng có số lượng lớn các tế bào chất chứa rất nhiều protein và cơ quan tế bào, ti lạp thể, các cơ quan tế bào chất mang thông tin di truyền. Tế bào chất của tế bào trứng liên quan đến sự thành công của quá trình thụ tinh in vitro.
1.6.2.4. Môi trường nuôi
Môi trường sử dụng để nuôi thành thục tế bào trứng không những ảnh hưởng đến sự thành thục của tế bào trứng mà còn có thể ảnh hưởng rất lớn khả năng thụ tinh và sự phát triển của phôi về sau (Rose và Bavister, 1992). Có nhiều loại môi trường được sử dụng để nuôi thành thục tế bào trứng, từ các môi trường có chức năng sinh lý đơn giản đến môi trường phức tạp có chứa các amino axít, các vitamin, purine và các hợp chất quan trọng để nuôi tế bào trứng. Tỉ lệ thành thục của nhân có thể thu được ở hầu hết các môi trường, nhưng môi trường TCM-199 được sử dụng rộng rãi nhất để nuôi thành thục tế bào trứng bò (Smetanina và cs., 2000; Mao và cs., 2002). Môi trường TCM-199 với các bicacbonat hoặc HEPES, bổ sung các loại huyết thanh khác nhau và các gonadotropin (như FSH và LH) hoặc các steroid hormone (như estradiol-17β) được sử dụng phổ biến nhất để nuôi thành thục tế bào trứng bò và thu được sự thành công khi nuôi thành thục tế bào trứng, thụ tinh và nuôi phôi in vitro.
Một số loại môi trường trên thị trường như Ham’s F-12 hay Weymouth’s medium MB 752/1 cho thấy kết quả thụ tinh và sự phát triển của phôi giảm đáng kể so với môi trường TCM-199 hay MEM (Rose và Bavister, 1992). Lý do cơ bản để lựa chọn một môi trường thích hợp xuất phát từ các phương pháp nuôi các loại tế bào khác nhau hoặc từ các thử nghiệm. Xác định các nhu cầu trao đổi chất và các điều kiện nuôi tối ưu được quan tâm nhiều
hơn. Các nghiên cứu cho thấy rằng, không có sự khác nhau đáng kể giữa các môi trường TCM-199, Menezo’s B2, CRlaa, môi trường Colorado và môi trường dịch ống dẫn trứng tổng hợp lên nuôi thành thục (Arlotto và cs., 1999). Sirard và Coenon (1993) cũng cho thấy không có sự khác nhau giữa môi trường nuôi thành thục tế bào trứng TCM - 199 và môi trường dịch ống dẫn trứng tổng hợp. Tuy nhiên môi trường nuôi thành thục tế bào trứng TCM-199 lại tốt hơn Ham’s F-10 (Bavister và cs., 1992; Pawshe và cs., 1996; Smetanina và cs., 2000).
1.6.2.5. Hormone và huyết thanh
Các nang trứng sắp rụng ở bò cho thấy, có sự thay đổi về môi trường của các gonadotropin, steroid, các yếu tố phát triển và các loại tế bào khác. Các yếu tố này hoạt động riêng biệt hay có sự phôi hợp với nhau có thể ảnh hưởng đến sự thành thục tế bào chất của tế bào trứng. Để đạt được sự thành thục đầy đủ in vitro của tế bào trứng, một số yếu tố quan trọng như: Bổ sung các loại hormone, các yếu tố phát triển và huyết thanh vào môi trường nuôi được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Hầu hết các nghiên cứu nuôi thành thục tế bào trứng đều sử dụng môi trường cơ bản bổ sung huyết thanh hoặc albumin kết tinh. Huyết thanh thai bê, huyết thanh bò động dục và albumin huyết thanh bò đều cho thấy kết quả tốt. Bổ sung protein vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng có thể ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ kết quả của toàn bộ kỹ thuật (Ali và cs., 2004). Huyết thanh thai bê hỗ trợ tỉ lệ thành thục của nhân tế bào trứng bò tốt hơn albumin huyết thanh bò (Leibfried và Rutledge và cs., 1989). Huyết thanh bò động dục có khả năng nâng cao tỉ lệ phát triển và thụ tinh in vitro của tế bào trứng bò (Sanbuissho và Threfall, 1985).
Huyết thanh bò động dục cho kết quả nuôi thành thục và thụ tinh in
ở thời điểm bắt đầu động dục tốt hơn huyết thanh bò sau khi động dục (Sanbuissho và Threfall, 1985). Bên cạnh ảnh hưởng của các huyết thanh lên sự thành thục của tế bào trứng thì sự có mặt của LH, FSH và estradiol 17β trong môi trường nuôi làm tăng sự thành thục của tế bào trứng và sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh in vitro (Brackett và Oliphan, 1975). Song Fukui (1989) lại cho thấy, không có sự ảnh hưởng của hormone lên sự thành thục của tế bào trứng và khả năng phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang.