4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
1.7.2.Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh của tế bào
Môi trường nuôi thành thục, bổ sung thêm các thành phần, xử lý tinh trùng, mật độ tinh trùng, thời gian tiếp cận giữa tinh trùng và trứng, môi trường được sử dụng và các điều kiện nuôi đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của quá trình thụ tinh và khả năng phát triển của hợp tử. Sự thành công của quá trình thụ tinh, đòi hỏi sự chuẩn bị tinh trùng và tế bào trứng thích hợp cũng như các điều kiện nuôi thuận lợi cho quá trình hoạt động trao đổi chất của giao tử đực và giao tử cái. Tinh trùng đủ về số lượng được cho vào môi trường thụ tinh có chứa heparin và được ủ với tế bào trứng trong khoảng thời gian tối ưu để thụ tinh.
Phương pháp chuẩn bị tinh trùng, số lượng tinh trùng, bổ sung hàm lượng heparin thích hợp và thời gian ủ tinh trùng với tế bào trứng có thể ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh in vitro.
1.7.2.1. Số lượng tinh trùng
Hầu hết kỹ thuật thụ tinh in vitro sử dụng mật độ tinh trùng khoảng 1 x 106 ml và quá trình thụ tinh hầu hết được tiến hành trong giọt môi trường thụ tinh 50 - 500 µl có chứa 5 - 40 tế bào trứng trong mỗi giọt và được phủ một lớp dầu khoáng. Tăng mật độ tinh trùng có thể làm tăng tỉ lệ phân chia, song lại có ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của phôi sau này. Nếu mật độ tinh trùng vượt quá 1,6 x 106/ml (Ling và Lu, 1990). Một số tác giả khác công bố rằng mật độ tinh trùng tối ưu với tỉ lệ tế bào trứng là 2000 khi sử dụng giọt thụ tinh 200 µl và mật độ tinh trùng là 2,5 x 106
/ml (Heres và cs., 1996). Saeki và cs. (1995) cho rằng tăng mật độ tinh trùng 1 x 104/ml lên 1 x 106/ml làm tăng khả năng thụ tinh khi bổ sung hoặc không bổ sung huyết thanh bò. Song để đạt được tỉ lệ phân chia và sự hình thành phôi dâu và phôi nang tốt nhất, mật độ tinh trùng sử dụng để thụ tinh in vitro có sự khác nhau giữa các con đực (Lu và Seidal, 2004).
1.7.2.2. Thời gian thụ tinh giữa trứng và tinh trùng
Quá trình thụ tinh thành công đóng vai trò quan trọng trong sản xuất phôi in vitro. Trong tự nhiên sự có mặt của tinh trùng vào thời điểm thụ tinh là rất ít. Thụ tinh in vitro tỉ lệ tinh trùng với trứng và thời gian nuôi 10.000 - 200.000/tế bào trứng và thời gian thụ tinh 16 - 24 h (Lambert và cs., 1983). Tế bào trứng được ủ với một số lượng lớn tinh trùng trong một lượng nhỏ môi trường cho thấy các enzyme thủy phân có thể có hại ảnh hưởng đến khả năng phát triển của tế bào trứng. Do vậy, một thời gian tối thiểu để đạt được sự thụ tinh tối ưu là sự mong muốn. Kochhar và cs. (2003) thấy rằng thời gian ủ tinh trùng và trứng trong khoảng thời gian 6 h cho tỉ lệ phát triển của hợp tử đến giai đoạn phôi nang cao nhất khi dùng tinh của các con đực khác nhau. Tỉ lệ thụ tinh cao đạt được khi ủ tinh trùng với tế bào trứng 20, 24 hay 28h cao hơn thời gian ủ 4, 8 và 16 h (Rehman và cs., 1994). Ngược lại Fukui và cs. (1990) thấy rằng liều heparin tối ưu làm cho tinh trùng bò có khả năng thụ tinh dao động từ 25 - 100 µg/ml, với thời gian tốt nhất là 5 - 6 phút. Dựa vào thời gian thụ tinh cần thiết để tinh trùng có khả năng thụ tinh trong đường sinh dục cái cho thấy, thời gian ủ tinh trùng và tế bào trứng 6h là tốt nhất (Danila, 2000) và hiện nay hầu hết các nhà nghiên cứu trên thể giới cũng như ở nước ta sử dụng thời gian là 5h khi thụ tinh in vitro.
1.7.2.3. Hàm lượng heparin trong môi trường thụ tinh
Heparin tương tự như glycosaminoglycan trong cơ quan sinh dục của bò, thúc đẩy sự không ổn định của các màng tế bào do vậy ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh của tinh trùng (Miller và Ax, 1990). Glycosaminoglycans có cấu trúc phức tạp, bao gồm: Heparin, heparan sulphat, chondroitin sulphat, dermatan sulphat, hyaluronic axít và keratan sulphat.Trong thụ tinh ống nghiệm, glycosaminoglycan là một tác nhân hiệu quả, giúp hoạt hóa tinh trùng, trong tự nhiên nó tồn tại rất nhiều trong nang trứng bò và được giải
phóng khi trứng vỡ và rụng vào loa kèn hay phễu của ống dẫn trứng. Ngoài ra glycosaminoglycan còn được tìm thấy trên toàn bộ đường sinh dục cái và được coi là thúc đẩy hoạt động của các hormone steroid buồng trứng.
Các thí nghiệm ủ tế bào trứng thành thục với tinh trùng trong môi trường BO chứa 20mg huyết thanh bò, 5 mM caffeine và 10 µg heparin/ml cho thấy sự kết hợp giữa heparin và caffeine làm tăng tỉ lệ xâm nhập lên 68%. Heparin có khả năng giống như glycosaminoglycan, có khả năng thực hiện quá trình phản ứng acrosome (Handrow và cs., 1982). Tanghe và cs. (2004); Mendes và cs. (2003) kết luận rằng, không có heparin trong môi trường thì quá trình thụ tinh in vitro không xảy ra, sự có mặt của heparin làm tăng tỉ lệ phân chia. Parrish và First (1984), đã sử dụng phương pháp xử lý tinh trùng ở nồng độ heparin (10µg/ml) để ủ tinh trùng tươi của bò trong tủ ấm 4 h và với tinh đông lạnh-giải đông là 0,5 h làm tăng đáng kể tỉ lệ thụ tinh. Nồng độ heparin dùng cho hoạt hóa tinh trùng là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh trong ống nghiệm của bò và sau đó là sự phát triển của phôi.
Hàm lượng heparin có sự khác nhau giữa các tác giả. Hàm lượng heparin 20 µg/ml môi trường thụ tinh (Camargo và cs., 2006). Fukui và cs. (1990) thấy rằng liều lượng heparine là 25 - 100 µg/ml với thời gian ủ thích hợp là 5 - 60 phút. Liều lượng heparine đến kết quả thụ tinh in vitro còn có sự khác nhau giữa tinh được khai thác từ các con đực khác nhau. Như vậy có sự biến động về sự báo cáo của các tác giả, song rõ ràng là heparine có ảnh hưởng đến tỉ lệ thụ tinh ở bò.
1.8. Nuôi phôi In vitro