4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
1.5.3.Một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng số lượng, chất lượng tế
trứng và kết quả tạo phôi in vitro khi siêu âm hút tế bào trứng.
1.5.3.1. Đầu dò siêu âm
Hashimoto và cs. (1998) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tần số đầu dò lên kết quả thu tế bào trứng thấy rằng, quan sát và xác định kích thước của nang trứng ở bò sống khi siêu âm hút tế bào trứng đóng vai trò hết sức quan trọng. Kết quả quan sát nang trứng cho thấy, hình ảnh siêu âm được tạo ra bởi đầu dò 7,5 MHz có khả năng quan sát toàn bộ buồng trứng tốt hơn, các nang trứng có kích thước 3 - 5 mm rõ nét hơn, số lượng nang trứng có màng cumulus chặt chẽ được hút nhiều hơn và số lượng tế bào trứng thu được nhiều hơn so với đầu dò 5,0 MHz.
Bên cạnh tần số, cấu tạo đầu dò cũng đóng một vai trò quan trọng khi quan sát, xác định kích thươc và thu tế bào trứng. Cấu tạo đầu dò khác nhau cho kết quả khác nhau. Nghiên cứu so sánh 2 loại đầu dò siêu âm (Bols và cs., 2003), cho thấy với nang trứng có kích thước trên 5 mm hình ảnh quan sát được không có sự khác nhau giữa đầu dò Esaote/Pie Medical ‘Linear aray’(di chuyển buồng trứng theo một hướng nhất định) và Esaote/Pie Medical ‘Annular Array Multi Angle’ (di chuyển buồng trứng theo nhiều góc độ khác nhau). Song khi quan sát nang trứng có kích thước < 5 mm đầu dò Esaote/Pie Medical ‘Annular Array Multi Angle’ cho hình ảnh tốt hơn do buồng trứng dễ dàng di chuyển theo nhiều góc độ khác nhau trong phạm vi của đầu dò. Ngoài ra đầu dò Esaote/Pie Medical ‘Annular Array Multi Angle’ có mặt quét rộng
hơn, cho phép di chuyển buồng trứng ở vị trí mà tay khó di chuyển, hạn chế tối đa tổn thương của buồng trứng và dây chằng buồng trứng (Hình 1.8).
Esaote/Pie Medical Esaote/Pie Medical
‘Linear aray’ Annular Array Multi Angle’ Hình 1.6. Khả năng thao tác và quan sát buồng trứng của 2 loại đầu dò
1.5.3.2. Áp lực hút
Để thu được tế bào trứng nằm trong nang trứng, cần phải có một áp lực hút nhất định để hút được dịch nang trứng ra ngoài. Áp lực hút có được nhờ máy tạo áp lực của hệ thống siêu ấm hút tế bào trứng tạo nên. Mức độ mạnh yếu của áp lực phụ thuộc vào sự điều chỉnh nút chức năng lớn nhỏ của người kỹ thuật. Tuy nhiên áp lực thực tế lại phụ thuộc rất lớn vào cấu tạo, độ dài và kích thước của ống dẫn dịch, kim hút tế bào trứng và kích cỡ của ống đựng dịch nang trứng. Chính vì vậy khi siêu âm hút tế bào trứng các nhà khoa học luôn nghiên cứu tìm ra một áp lực hút thích hợp với hệ thống thiết bị siêu âm hút tế bào trứng của mình. Nếu sử dụng áp lực hút quá yếu sẽ không hút được hết được dịch nang trứng, nhưng nếu sử dụng một áp lực hút quá mạnh sẽ làm tổn thương đến tế bào cumulus, khối tế bào chất và các chức năng khác của tế bào trứng. Do vậy mà áp lực hút có sự biến động rất lớn giữa các nhà khoa học trên thế giới, dao động từ 40 - 400 mmHg. Moreno (1993) sử dụng áp lực hút 120 mmHg, Gibbons (1994) sử dụng áp lực hút 75 mmHg và Ward và cs. (2000) sử dụng áp suất 90 mmHg tá. Các tác giả đều có kết luận rằng, ở các mức độ áp lực khác nhau, thấy rằng có mối quan hệ tuyến tính giữa các áp lực
hút được sử dụng và số lượng dịch hút ra trong mỗi phút, số lượng trứng và phôi thu được rất khác nhau.
1.5.3.3. Tần suất hút
Khi siêu âm hút tế bào trứng, các nang trứng ở các mức độ kích thước khác nhau được hút ra. Qua trình này đã làm thay đổi về mặt số lượng và kích thước của các nang trứng có mặt trên buồng trứng. Bên cạnh đó, buồng trứng cũng bị tổ thương do các vết thương do kim hút tế bào trứng gây nên làm thay đổi sự phát triển bình thường của sinh lý sinh sản, đặc biệt là sự hoạt động của buồng trứng và sự phát triển của các nang trứng. Với tần suất hút khác nhau có sự khác nhau hay không và kết quả ở các tần suất hút có khác nhau hay không,… được nhiều nhà khoa học trên thể giới quan tâm nghiên cứu. Nhìn chúng kết quả vẫn còn nhiều biến động giữa các nhà khoa học và giữa các nhóm bò thí nghiệm, song các tác giả (Gibbons và cs., 1994; Kruip và cs., 1994; Garcia và Salaheddine, 1998) đều có chung kết luận có sự ảnh hưởng tần suất đến số lượng, chất lượng trứng, hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu được thu. Merton và cs. (2003) đã nghiên cứu và thấy rằng khoảng cách giữa các lần lấy ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ phôi thu được. Số lượng tế bào trứng thu được ở khoảng cách 7 ngày cao hơn 3 - 4 ngày, nhưng mật độ tế bào cumulus lại cao nhất khi khoảng cách lấy là 3 ngày, tương tự số lượng phôi nang thu được cũng khác nhau ở các khoảng cách khác nhau, cao nhất khi khoảng cách là 3 ngày và thấp nhất là 5 ngày. Viana và cs. (2004) lại có kết luận rằng, không có sự khác nhau về kích thước và số lượng nang trứng ở tần suất ½ tuần/lần và 1 tuần/lần (P < 0,05), tỉ lệ tế bào trứng loại A ở tần suất ½ tuần/lần cao hơn tần suất 1 tuần/lần (P < 0,01), tỉ lệ phân chia không có sự khác nhau giữa hai tần suất, nhưng tỉ lệ phôi nang thu được ở tần suất ½ tuần/lần cao hơn tần suất 1 tuần/lần (p < 0,01; tương ứng: 31,8% so với 21,6%).
1.5.3.4. Kích thước nang trứng
Kích thước nang trứng có sự liên quan mật thiết với các giai đoạn phát triển của nang trứng và tế bào trứng. Do vậy ảnh hưởng kích thước nang trứng lên khả năng phát triển của tế bào trứng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu, song các kết quả giữa các nghiên cứu khác nhau rất nhiều. Một số nhà khoa học công bố rằng tế bào trứng thu từ nang trứng có kích thước lớn (4 - 6 hay 8 mm) cho tỉ lệ phôi nang cao hơn các nang trứng có kích thước nhỏ hơn. Blondin và Sirard (1995), lại thấy rằng không có sự khác nhau nhiều về khả năng phát triển giữa các tế bào trứng thu từ nang trứng có kích thước 3 - 5 mm và nang trứng có kích thước từ 5 mm trở lên. Tương tự, Hagemann và cs. (1999), cũng không tìm thấy sự khác nhau về khả năng phát triển giữa tế bào trứng thu được từ nang trứng có kích thước 3 - 5mm và nang trứng có kích thước 6 - 8mm. Khả năng phát triển của tế bào trứng ở các nang trứng có kích thước 2 mm trở lên không có sự khác nhau về sự phân chia và phôi nang (Yang và cs., 1998). Song Lonergan và cs. (1994) đã báo cáo rằng tỉ lệ phôi nang thu được là 66% ở các nang trứng có kích thước từ 6mm trở lên, trong khi đó nang trứng có kích thước từ 2 - 6 mm cho tỉ lệ phôi nang thu được chỉ có 34% và các nang trứng có kích thước 6 mm trở lên.
Như vậy có thể nói kích thước nang trứng có sự ảnh hưởng đến kết quả siêu âm hút tế bào trứng và tạo phôi in vitro.
1.5.3.5. Pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội
Ở các pha phát triển của nang trứng trong một đợt sóng nang ảnh hưởng rất lớn đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được. Hendriksen và cs. (2004), đã nghiên cứu thấy rằng có sự ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội lên khả năng phát triển của tế bào trứng sau khi thụ tinh in vitro, phát triển đến giai đoạn phôi nang tương đối cao ở ngày thứ 2 và ngày thứ 5 của sóng nang tương ứng 27 và 29% và thấp hơn ở ngày
thứ 8 (15%). Machatkova và cs. (2000), gây động dục bằng cách tiêm PGF2α và siêu âm hút tế bào trứng tất cả các ngày thứ 1, 2 và 3 của chu kỳ (ngày động dục ngày 0), thấy rằng tỉ lệ phôi nang ở ngày thứ 1 thấp hơn ngày thứ 2 và 3 ( tương ứng 12,8% so với 27,8% và 27,5%). Điều này được Machatkova và cs. (2000) giải thích là do số lượng nang trứng ở ngày thứ 1 vẫn còn bị ức chế bởi nang trội.
1.5.3.6. Ảnh hưởng của FSH
Nghiên cứu sử dụng FSH để kích thích sự phát triển nang trứng trước khi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng bò, được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu thành công và thu được nhiều kết quả khả quan. Goodhand và cs. (2000) đã nghiên cứu, sử dụng FSH để kích thích sự phát triển của nang trứng trước khi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống và tạo phôi trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy tổng số nang trứng ở thời điểm siêu âm hút tế bào trứng tăng từ 17,7 nang ở bò không sử dụng FSH lên 23,6 nang ở bò được sử dụng FSH. Số lượng nang trứng được hút ra theo mức độ sử dụng FSH (không sử dụng FSH 9,7 nang, tiêm 1 liều trước khi siêu âm hút tế bào trứng 13,6 nang và tiêm nhiều liều FSH là 17,3 nang). Số lượng tế bào trứng bình quân thu được hàng tuần cũng tăng lên (không sử dụng FSH 4,1 tế bào trứng, tiêm một liều trước khi siêu âm hút tế bào trứng 5,3 tế bào trứng và tiêm nhiều liều FSH trước khi siêu âm hút tế bào trứng là 5,9 tế bào trứng). Nghiên cứu của tác giả cũng cho thấy rằng, không có sự khác nhau về tỉ lệ tạo phôi hay số phôi đủ tiêu chuẩn cấy, nhưng số phôi thu được khi sử dụng FSH là lớn nhất.
Khác với nghiên cứu trên Goodhand và cs. (1999) đã tiến hành nghiên cứu siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống và tạo phôi trong ống nghiệm ở các tần suất khác nhau sử dụng FSH để kích thích. Ông và cộng sự tiến hành thí nghiệm ở 24 bê Simmental với các tần suất: 1) 1 lần/tuần; 2) 2 lần/tuần và 3)
siêu âm hút tế bào trứng 1 lần/tuần có sử dụng FSH để kích thích 3 ngày nang trứng phát triển trước khi siêu âm hút tế bào trứng. Số lượng nang trứng/bê/tuần có mặt ở buồng trứng khi siêu âm hút tế bào trứng ở bê siêu âm hút tế bào trứng 1 lần/tuần (14,7 nang) thấp hơn nhiều so với bê siêu âm hút tế bào trứng 2 lần/tuần (27, 4) và 1 lần/tuần có sử dụng FSH để kích thích (23,1). Ở bê có sử dụng FSH cho chất lượng tế bào trứng tốt hơn, số lượng tế bào trứng có 4 lớp màng cumulus trở lên cao hơn. Số lượng phôi dâu và phôi nang/bê/tuần thu được ở tần suất siêu âm 2 lần/tuần và 1 lần/tuần sử dụng FSH để kích thích lớn hơn bê siêu âm hút tế bào trứng 1 lần/tuần, tương ứng 2,4 phôi, 2,1 phôi và 1,0 phôi.
1.5.3.7. Giống bò
Ảnh hưởng của giống lên khả năng phát triển của tế bào trứng và phôi thể hiện rất rõ ở một số loài động vật. Ở một số giống chuột, phôi in vitro phát triển đến giai đoạn phôi nang, trong khi phôi từ một số giống khác lại chỉ phát triển đến giai đoạn 1 và 2 tế bào (Goddard và Pratt, 1993). Sự khác nhau này có thể là do nguyên nhân một số yếu tố gen trưởng thành hoặc tế bào chất (Bavister, 1996).
Ở bò, nguồn tế bào trứng cả ở bò sữa và bò thịt ảnh hưởng đến tỉ lệ phôi nang thu được (Fischer và cs., 2000). Ảnh hưởng của giống bò lên chất lượng tế bào trứng trở nên rõ ràng khi đánh giá ở các điều kiện môi trường khác nhau. Liên quan đến stress nhiệt thì tỉ lệ phôi nang giảm cả ở giống bò sữa thuần và giống bò Brahman. Ở giống bò có u có khả năng cao về điều chỉnh nhiệt độ cơ thể tốt hơn ở bò sữa thuần (Block và cs., 2002; Paula và cs., 2003). Đặc trưng này có thể do sự thích nghi về mặt di truyền ở mức độ tế bào, cho phép giống bò có u sống sót tốt hơn ở khí hậu nóng (Paula Lopes và cs., 2003), vì vậy khả năng phát triển của tế bào trứng cao hơn giống bò sữa thuần (không có u) khi nuôi trong điều kiện môi nắng nóng.
Bảng 1.2. Số lượng tế bào trứng và tỉ lệ phôi nang thu được ở các giống bò khác nhau
Tác giả Giống Tế bào trứng thu
được (trứng/lần) Tỉ lệ phôi nang thu được (%) Roth và cs., (2008) Bò sữa thuần 17,2 39,5 De Roover và cs., (2008) Bò xanh Bỉ 4,1 17,0 Chaubal và cs., (2006) Bò lai Angus 3,9 21,0 Lopez và cs., (2006) Bò sữa thuần Giống bò đỏ và trắng 6,0 4,3 28,0 25,0 (Su và cs., 2009)
Murrah lai với Brahmann
(12 tháng tuổi) 7,3 45,9 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Machado và cs.,
(2006) German Simental 8,7 18,9
Ảnh hưởng của ưu thế lai lên sản xuất phôi in vitro được đánh giá bằng cách sử dụng giao tử từ giống bò có U và bò không có U (Fischer và cs., 2000). Cho thấy tỉ lệ phôi nang thu được ở bò không có U thuần chủng hơn bò có U và bò lai. Điều này cho thấy một số đối kháng bộ di truyền giữa giống bò có U và giống bò không có U làm giảm sự phát triển của những phôi được sản xuất in vitro. Như vậy cũng có nghĩa là sử dụng phôi được sản xuất
in vitro có thể kém hiệu quả hơn ở giống bò có U và bò F1. Tuy nhiên sản xuất phôi ở Brazil lại cho thấy phôi nang thu được ở giống bò có U cao hơn bò sữa (Camargo và cs., 2006) và sử dụng tinh bò sữa để sản xuất phôi từ tế bào trứng của bò có U thu được tỉ lệ phôi nang 27,3%. Như vậy có thể nói rằng, có sự biến động giữa các giống bò về số lượng tế bào trứng và tỉ lệ phôi nang thu được (Bảng 1.4).
1.5.3.8. Tuổi bò
Tất cả các loài động vật có vú đều có sự liên quan mật thiết giữa tuổi và khả năng sinh sản trong tự nhiên và quá trình sản xuất phôi in vivo và in vitro.
Sự hạn chế kết quả sản xuất phôi dâu và phôi nang trong quá trình sản xuất phôi in vitro là do sự biến động về chất lượng tế bào trứng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, chất lượng tế bào trứng là yếu tố chính, ảnh hưởng đến số lượng phôi nang thu được. Trong đó, yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng là tình trạng sinh lý sinh sản của bò cho tế bào trứng. Các nghiên cứu cho thấy, bò cho số lượng tế bào trứng ít hơn bê tơ. Nghiên cứu về ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng lên số lượng phôi nang thu được sau khi thụ tinh in vitro của Mermillod và cs. (1992) thấy rằng, bê cho tế bào trứng cho có độ tuổi 1 - 3 cho kết quả phôi nang thu được cao hơn bò trưởng thành. Khả năng phát triển của tế bào trứng từ bê chưa trưởng thành được nâng lên theo độ tuổi và đặc biệt tăng khả năng phân chia ở giữa tháng thứ 7 và tháng thứ 9 (Yang và cs., 1998). Khi gây rụng trứng nhiều ở bò già kết quả cho thấy kích thước các nang trứng < 6 mm, 9 – 11 mm và > 12 mm ít hơn so với bò ít tuổi hơn (Mahl và cs., 2008). Kết quả nghiên cứu của Rizos và cs. (2005) cho thấy, số lượng nang trứng được hút ở bê cao hơn ở bò ở giai đoạn đầu của chu kỳ vắt sữa (tương ứng: 10,4 và 7,8) và số lượng phôi nang thu được ở bê cũng cao hơn (tương ứng: 4,7 và 2,8 phôi). So sánh khả năng phát triển in vitro của tế bào trứng thu được ở bò non có độ tuổi 12 tháng tuổi, bò 7 - 8 tuổi và bò già có độ tuổi từ 5 tuổi trở lên (Su và cs., 2009) cho thấy, tỉ lệ phân chia và tỉ lệ phôi nang thu được cao nhất ở bò non, tiếp đến là bò 7 - 8 tuổi và thấp nhất là bò già. Mức độ progesterone trong huyết thanh ở bò non thấp hơn ở bò già trong suốt chu kỳ động dục khi không tiến hành siêu âm hút tế bào trứng cũng như trong suốt quá trình siêu âm hút tế bào trứng. Tác giả Roth và cs. (2008) đã nghiên cứu khả năng phát triển của các tế bào trứng bò thu ở các độ tuổi khác nhau thấy rằng, không có sự khác nhau về số lượng tế bào trứng thu được, tỉ lệ phân chia và phôi nang thu được ở bê sữa và bò đẻ nhiều lứa ở thời