4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
1.8.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của phôi
1.8.2.1. Chất lượng hợp tử
Những tế bào trứng có chất lượng A, B hay loại 1 và loại 2, được nuôi
thành thục và cho thụ tinh với tinh trùng. Đánh giá chất lượng hợp tử thường được thực hiện 16 - 18 h sau khi tế bào trứng được thụ tinh in vitro nhằm xác định được khả năng phát triển của hợp tử về sau. Chất lượng hợp tử thường được đánh giá dựa và tiền nhân và hạch nhân. Van Blerkom. (1990) là người phát hiện ra sự đối xứng và kích thước của tiền nhân, số lượng và vị trí của hạch nhân có sự liên quan mật thiết đến tỉ lệ có chửa. Scott và cs. (2000) dựa vào số lượng và sự phân bố của hạch nhân trong tiền nhân để phân loại tốt xấu theo thứ tự từ 1 đến 4, căn cứ vào kích thước nhân, sự liên kết của nhân, sự liên kết của hạch nhân, sự phân bố và vị trí của nhân trong hợp tử như sau: 1) Có tiền nhân bằng nhau. Số lượng và kích thước của hạch nhân bằng nhau, có sự liên kết của hai tiền nhân ở chỗ nối của tiền nhân. Số lượng tối đa của hạch nhân dao động từ 3 – 7; 2) Có số lượng tiền nhân bằng nhau. Số lượng và kích thước của hạch nhân bằng nhau, nằm rải rác ở cả 2 tiền nhân. Số lượng tối đa của hạch nhân dao động từ 3 – 7; 3) Có tiền nhân bằng nhau. Số lượng hạch nhân bằng nhau, kích thước của hạch nhân không đồng đều. Các tiền nhân khác có các hạch nhân nằm rải rác ngẫu nhiên. Số lượng tối đa của hạch nhân khoảng từ 3 – 7; 4) Có tiền nhân không bằng nhau hoặc tách rời. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi và có rất nhiều báo cáo xác định rằng là phương pháp có hiệu quả để lựa chọn được hợp tử có chất lượng tốt, tỉ lệ có chửa cao (Hình 1.6). Theo Munne và Cohen. (1998; Manor và cs., 1999), sự phân chia hợp tử ở loại 1 và loại 2 thường có sản lượng phôi về sau thu được tốt. Ngoài ra, khi cấy chuyển những phôi này cho bò nhận phôi cho
tỉ lệ có chửa cao hơn. Mặt khác, loại 3 hợp tử phát triển thành phôi có chất lượng kém hơn và khả năng cấy thấp hơn. Hợp tử ở mức độ loại 4 rất thường xuyên bị ảnh hưởng bởi sự bất thường của nhiễm sắc thể và thể dị bội, vì vậy phôi đó không nên cấy và sử dụng cho mục đích sinh sản.
Loại 1 Loại 2 Loại 3
Loại 4
Hình 1.7. Phân chia chất lượng hợp tử (Nguồn: Scott và cs., 2000) Tesarik và cs. (1999) cũng đánh giá chất lượng hợp tử vào khoảng thời gian 16 - 18 giờ sau khi thụ tinh, dựa vào đặc điểm của tiền nhân và hạch nhân. Tiền nhân có kích thước và số lượng cân đối. Hạch nhân có kích thước và số lượng bằng nhau. Có sự xuất hiện của tế bào chất. Các hợp tử được phân thành sáu mức độ. Theo ông, ở mức độ 0 tương ứng với các hợp tử bình thường và mức độ 1-5 đại diện cho thay đổi bất thường của hình thái hợp tử.
Sự xuất hiện thể cực thứ hai và tế bào chất cũng đóng vai trò quan trọng khi đánh giá chất lượng phôi. Sự phân cực của tế bào trứng là tiền đề để xác định chính xác vị trí trên trục kéo dài của tiền nhân, xác định các chức năng khác nhau của hai cực hợp tử. Sự sắp xếp lại của các cơ quan tế bào ảnh hưởng đến tương lai của phôi bào khi hợp tử phân chia. Quầng sáng và các quầng quanh tiền nhân là dấu hiệu của sự phân cực hợp tử. Các bất thường trong mối quan hệ không gian giữa tiền nhân và thể cực là những dấu hiệu liên quan đến rối loạn phân chia sắp xảy ra. Thường các hợp tử có hai cực không bằng nhau thì có sự phân chia chậm hơn (Hình 1.7). Phôi kém chất lượng và giảm tốc độ tăng trưởng (Garello và cs., 1999).
Hợp tử có hai thể cực bằng nhau Hợp tử có hai thể cực bằng nhau
Hình 1.8. Hợp tử (Nguồn: Scott và cs., 2000)
1.8.2.2. Chất lượng phôi ở giai đoạn phân chia
Đánh giá chất lượng phôi ở giai đoạn phân chia được thực hiện trong khoảng thời gian 24 - 48 giờ sau khi thụ tinh, khi xuất hiện sự phân chia đầu tiên của tế bào phôi để đánh giá và tìm ra những phôi có khả năng phát triển và phôi có chất lượng tốt. Ziebe và cs. (1997) đánh giá chất lượng phôi ở giai đoạn đầu dựa vào sự cân đối và mức độ tách rời của tế bào phôi. Phôi có chất lượng tốt là những phôi có hai tế bào phôi cân đối và có sự liên kết chặt chẽ. Những phôi có phân chia đầu tiên của tế bào phôi 24 - 28 giờ sau khi thụ tinh, thường có tỉ lệ đậu thai thấp, ngay cả các phôi với hình thái tốt vào thời điểm cấy.
Tỉ lệ phát triển của phôi (phân chia) được đánh giá trong nhiều nghiên cứu. Gần như chắc chắn rằng số lượng tế bào phôi cao cho thấy tỉ lệ đậu thai cao hơn. Tần số phân chia liên quan đến khả năng phát triển của phôi. Những phôi có từ bốn tế bào phôi trở xuống vào ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, cho thấy khả năng phát triển rất thấp và tỉ lệ có chửa của phôi này sau khi cấy là rất thấp. Phôi chất lượng tốt phải có ít nhất 4 tế bào vào ngày thứ hai và ít nhất 8 tế bào vào ngày thứ ba sau khi thụ tinh .
Các lần đánh giá chất lượng phôi ở giai đoạn đầu vào khoảng thời gian 40-44 giờ và 64 - 68 giờ sau khi thụ tinh là tốt nhất. Phôi được chia thành các nhóm, tùy thuộc vào một số đặc điểm về hình thái học. Bên cạnh số lượng tế
Thể cực Tiền nhân Các hạch nhân
bào, sự xuất hiện của tế bào chất không bình thường hoặc các mảnh tế bào rời rạc là những đặc điểm thường được sử dụng để đánh giá. Như vậy, để đạt được hiệu quả cao trong quá trong quá trình sản xuất phôi, cấy phôi cho bò nhận việc đánh giá chất lượng hợp tử, phôi đóng vai trò hết sức quan trọng. 1.9. Ảnh hưởng của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đến kết quả nuôi
thành thục, thụ tinh và tạo phôi in vitro
Kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đã mở ra một bước ngoặt mới trong quá trình sản xuất phôi in vitro. Việc thu tế bào trứng từ bò sống cho phép chúng ta có thể lựa chọn năng suất và chất lượng bò cho tế bào trứng. Quá trình thu tế bào trứng được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo ra một số lượng lớn phôi có giá trị di truyền cao trong cùng một đơn vị thời gian và trên cùng một cá thể. Bên cạnh các ưu điểm trên, chất lượng tế bào trứng và phôi tạo ra cho kết quả cao hơn so với tế bào trứng được thu từ lò mổ, số lượng phôi thu được lên đến 4.7 phôi/lần siêu âm hút tế bào trứng và tỉ lệ phôi nang 48 % (Hasler, 2003). Song kết quả nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi in vitro chịu ảnh hưởng rất lớn của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng.
Ảnh hưởng của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đến khả năng thành thục, quá trình thụ tinh và tạo phôi in vitro liên quan mật thiết đến chất lượng tế bào trứng. Chất lượng tế bào trứng được thể hiện thông qua chất lượng của các thành phần cấu tạo nên tế bào trứng như: màng cumulus, tế bào chất, nhân tế bào và rất nhiều thành phần khác của tế bào trứng. Hình thái học của tế bào trứng là một trong các cơ sở để chúng ta lựa chọn tế bào trứng trước khi nuôi thành thục và thụ tinh trong ống nghiệm (Khurana và Niemann, 2000). Song để hút được các tế bào trứng ra khỏi các nang trứng cần phải hiểu rõ cấu tạo và chức năng của hệ thống siêu âm hút tế bào trứng và sử dụng tốt từng thiết bị và công đoạn kỹ thuật. Mỗi một thiết bị trong hệ thống siêu âm đều ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng.
Màn hình và đầu dò siêu âm có sự liên quan mật thiết với nhau. Màn hình máy siêu âm hút tế bào trứng cần phải được điều chỉnh về độ sáng tối và độ nét phù hợp với từng cá thể và ánh sáng nơi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng. Độ sắc nét cao, khả nang quan sát tế bào trứng càng rõ bấy nhiêu, tăng khả năng quan sát và chọc hút. Cách cố định, di chuyển buồng trứng ở phía đầu dò siêu âm cần phải phù hợp với cấu tạo và sự phân bố của các nang trứng có mặt trên buồng trứng. Kỹ thuật cố định và di chuyển buồng trứng là yếu tố kỹ thuật rất quan trọng để thu được tối đa số lượng nang trứng có chất lượng tốt.
Tần suất hút tế bào trứng đóng vai trò quan trọng, liên quan đến số lượng, kích thước của nang trứng có mặt trên buồng trứng và liên quan đến pha của sóng nang vào thời điểm siêu âm hút tế bào trứng. Nếu khoảng cách quá dài sau khi siêu âm hút tế bào trứng, một đợt nang trứng mới lại xuất hiện (Viana và cs., 2010) và hình thành nên các nang trội, ức chế các nang trứng còn lại dẫn đến số lượng và chất lượng tế bào trứng bị giảm do hàm lượng inhibin tăng cao làm ức chế FSH. Song nếu tần suất quá gần nhau làm cho các nang trứng chưa kịp phát triển đến kích thước ≥ 2mm, ở kích thước này các nang trứng có khả năng thành thục và phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang.
Trong kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng, áp lực hút liên quan đến chất lượng tế bào trứng. Nếu áp lực hút quá yếu, khả năng hút tế bào trứng và dịch nang trứng ra kém. Mặt khác khi áp lực hút yếu quá trình hút bị chậm lại làm cho dịch nang trứng sẽ tràn qua lỗ kim đâm, kéo theo một lượng nhất định tế bào trứng chảy ra ngoài. Nhưng khi sử dụng áp lực hút lớn tế bào trứng sẽ bị tác động do tốc độ dòng xoáy và tốc độ di chuyển của tế bào trứng làm cho màng cumulus bị lột trần và các tổ chức bên trong tế bào bị tổn thương làm giảm khả năng thành thục, thụ tinh và kết quả tạo phôi in vitro.
Có thể nói rằng, để nâng cao được khả năng thành thục, thụ tinh và kết quả tạo phôi in vitro khi siêu âm hút tế bào trứng cần phải nâng cao được chất lượng tế bào trứng.
CHƯƠNG 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
- Bò cho tế bào trứng ở các thí nghiệm là bò sữa HF và bò lai hướng sữa F3 (Holstein Friesian x Lai Sind), có độ tuổi 3 – 8, đang sinh sản bình thường điểm thể trạng 2,5 - 3 và không mang thai.
- Tinh cọng rạ sử dụng để thụ tinh in vitro trong các thí nghiệm là bò HF của cùng một con đực, có năng suất từ 10.000 lít sữa trở lên trong một chu kỳ vắt sữa, được nhập từ Mỹ, hoạt lực tinh trùng trên 40% và đã được kiểm tra năng suất qua đời sau.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút.
- Nghiên cứu ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào trứng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nang trứng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội. - Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng FSH.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giống bò. - Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi bò. - Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ.
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
2.1.3.1. Siêu âm hút tế bào trứng
Trước khi siêu âm hút tế bào trứng, bò cho tế bào trứng được cố định trong giá, lấy hết phân trong trực tràng, rửa sạch và sát khuẩn bằng cồn 700
, gây tê cục bộ bằng cách tiêm 4 - 6 ml lidocain 2% vào khấu đuôi. Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện bằng màn hình siêu âm (HS-2000, HONDA
Electronics Co., Ltd, Japan) và đầu dò siêu âm có đường dẫn kim hút tế bào trứng 7,5 MHz (HBV-4710 MV, Fujira In dustry Co., Ltd, Japan). Tất cả các nang trứng có kích thước 2 mm trở lên được hút bằng máy tạo áp suất (FHK, Model 4, Tokyo, Japan) được nối với kim hút tế bào trứng một đường dẫn (dài 55 cm, 18 G, COVA, Missawa Medical Industry Co., Ltd, Japan). Trước khi hút tế bào trứng, kim được nối với hệ thống ống dẫn, được đổ đầy dịch hút tế bào trứng mDPBS của Sigma, bổ sung 2% heparin (Aventis Pharma Ltd, Tokyo, Japan) và 5% huyết thanh bê mới sinh (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) và kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml). Đồng thời ống dẫn dịch hút tế bào trứng được nối với ống đựng dịch hút tế bào trứng và dịch nang trứng 50 ml, được giữ trong bình ổn nhiệt (Fujihira industry Co., Ltd, Japan) ở 370
C. Cho đầu dò siêu âm vào vị trí trong cùng của ngách âm đạo, cố định và đưa buồng trứng sát với đầu dò siêu âm, dùng kim chọc thủng qua thành âm đạo và chọc thủng nang trứng đã được xác định, dịch chuyển buồng trứng để hút các nang bên cạch. Hút 3 – 5 hoặc có thể đến 10 nang trứng thì kim được rút ra, cho đầu kim vào ống đựng dịch hút tế bào trứng để hạn chế sự đông máu làm tắc kim và hệ thống dẫn dịch. Tiếp tục thao tác lặp đi lặp lại như trên để tiếp tục hút hết các nang trứng ở cả hai buồng trứng. Sau khi siêu âm hút tế bào trứng xong, dịch nang trứng được lọc, sử dụng lọc phôi (EMCON, Spring Walley, WI, USA) và tìm phôi dưới kính hiển vi soi nổi.
2.1.3.2. Đánh giá chất lượng tế bào trứng
Tất cả các tế bào trứng sau khi tìm được, được tiến hành đánh giá phân loại trên kính hiển vi soi nổi theo phương pháp của tác giả Goodhand và cs. (2000). Tế bào trứng được chia ra thành 4 loại theo thứ tự từ tốt đến xấu: - Loại A: Có 4 lớp màng cumulus trở lên, phân bố rõ ràng, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất.
- Loại B: Có 1 lớp màng tế bào cumulus trở lên, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất.
- Loại C: Một số phần vỏ ngoài tế bào trứng bị lột trần, tế bào chất co lại không đều.
- Loại D: Tế bào trứng hoàn toàn bị lột trần và tế bào chất co lại không đều.
2.1.3.3. Nuôi thành thục tế bào trứng
Tế bào trứng loại A, B được nuôi thành thục theo quy trình của một số tác giả đã công bố như Saitoh và cs. (1995), Kajihara và cs. (1999), Numabe và cs. (2000), Imai và cs. (2006). Các tế bào trứng được rửa một lần trong môi trường hút tế bào trứng và rửa 2 lần trong môi trường nuôi thành thục tế bào trứng TCM-199 (GIBCO-BRL, Gland Island, NY, USA) bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh và kháng sinh. Sau đó 20 tế bào trứng loại A,B được nuôi 20 đến 22 h trong 100 µl giọt môi trường nuôi TCM-199 (Sigma Chemical St. Louis, MO, USA) bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh ((Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) và kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml) trong đĩa petri đường kính 35 mm (Falcol 1008, Becton Dickinson Co. Ltd., Oxnard CA, USA), các giọt nuôi được phủ dầu khoáng (paraffin oil (Praffin liquid, Nacalai Tesque ICN, Kyoto, Japan), pH được điều chỉnh ở mức 7,3 - 7,4. Khi số lượng tế bào trứng nuôi ít hơn 20 tế bào trứng thì theo tỉ lệ cứ một tế bào trứng sử dụng 5µl môi trương nuôi. Quá trình nuôi được duy trì ở nhiệt độ 38,50
C, trong điều kiện 5% CO2 và độ ẩm tối đa.
2.1.3.4. Hoạt hóa tinh trùng
Việc hoạt hóa tinh trùng được thực hiện trong môi trường BO theo một số tác giả đã công bố như Saitoh và cs. (1995), Kajihara và cs. (1999), Numabe và cs. (2000), Imai và cs. (2006). Sau khi nuôi thành thục tế bào trứng được lấy ra khỏi môi trường nuôi thành thục tế bào trứng và rửa trong
môi trường thụ tinh in vitro BO (Brackett and Oliphant), được bổ sung 10 mg/ml Albumin huyết thanh bò (Sigma Chemical St. Louis, MO, USA). Sau khi rửa, tế bào trứng thành thục được thụ tinh với tinh trùng đã được hoạt hóa. Hai cọng rạ tinh bò Holstein Friesian 0,25 ml lấy ra khỏi bình ni tơ lỏng, được