4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
1.7.1. Thụ tinh in vitro
Để tạo phôi in vitro, các tế bào trứng sau khi nuôi thành thục được tiến hành thụ tinh in vitro với tinh trùng đã được hoạt hóa. Những nghiên cứu đầu tiên để sản xuất phôi bò in vitro cho thấy, phôi thụ tinh in vitro có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang và có thể sống được trong tử cung (Sirard và cs., 1988). Tuy nhiên vẫn có nhiều báo cáo cho thấy, có một số vấn đề không bình thường về siêu cấu trúc ở phôi được nuôi thành thục và thụ tinh in vitro so với phôi thành thục và thụ tinh in vivo. Những bất thường thường thấy như chậm phát triển và sự phát triển không bình thường của tiền nhân, đa tinh trùng. Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới không ngừng nghiên cứu về phương pháp thụ tinh in vitro và đặc biệt là nghiên cứu về môi trường nuôi thành thục tế bào trứng, môi trường thụ tinh và môi trường nuôi phôi.
Môi trường Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate Medium (Fert-TALP) thường được dùng để thụ tinh bò in vitro (Bavister, 1996). Tuy nhiên sự thay đổi môi trường như SOF, CR1aa và Defined Medium (Brackett và Oliphant, 1975) đã được sử dụng thành công trong thụ tinh bò in vitro.
Tế bào trứng bò có khả năng duy trì sự thụ tinh trong khoảng thời gian 20 - 24 h sau khi rụng khỏi nang trứng. Sự thâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng in vitro ở khoảng thời gian 3 h sau khi thụ tinh và tiếp tục thâm
nhập vào tế bào trứng cho đến 24 h sau khi thụ tinh. Tế bào trứng bò thường được ủ với tinh trùng đã được hoạt hóa và tính tỉ lệ tinh trùng thích hợp ở nhiệt độ 390
C, CO2 5% và độ ẩm không khí tối đa. Tế bào trứng bò được thụ tinh ở giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào quyết định khả năng phát triển của phôi. Tế bào trứng được thụ tinh vào khoảng thời gian 8h sau khi đạt đến pha giữa II của thời kỳ phân bào có khả năng phát triển cao hơn các tế bào trứng được thụ tinh ngay khi phát triển đến gia đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào. Điều này cho thấy khả năng hỗ trợ quá trình thụ tinh và phát triển của phôi về sau của tế bào trứng liên quan đến sự thành thục của nhân.
Để quá trình thụ tinh xảy ra, tinh trùng bò cần phải được hoạt hóa. Tinh trùng của động vật có vú có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng thành thục chỉ sau khi chúng có một thời gian di chuyển ở trong đường sinh dục cái (Austin, 1951; Chang, 1951), đây cũng là khái niệm đầu tiên về hoạt hóa tinh trùng (Capacitation). Và hiện nay quá trình hoạt hóa tinh trùng đã được hiểu một cách đầy đủ, là quá trình mà ở đó tinh trùng diễn ra một loạt các phản ứng sinh hóa và sinh lý phức tạp trước khi có khả năng thụ tinh với tế bào trứng thành thục. Người ta cho rằng các giai đoạn đầu tiên của hoạt hóa có liên quan đến việc loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống sinh tinh, dịch hoàn phụ, ống dẫn tinh và tinh thanh. Trong đó khái niệm của Furuya và cs. (1992) nói đến tầm quan trọng của acrosome, với ống hoạt hóa là một chuỗi thay đổi sinh hóa mà những thay đổi đó làm cho tinh trùng có thể diễn ra phản ứng acrosome khi tiếp xúc với màng trong suốt, mà màng trong suốt dường như là tác nhân sinh lý gây nên phản ứng đó. Ở bò, dựa vào sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên vào tế bào trứng sau khi thụ tinh nhân tạo, Hunter (1985) cho biết thời gian cần cho hoạt hóa của tinh trùng trong đường sinh dục cái khoảng 6 h. Nhưng cũng đã có nhiều dẫn chứng cho thấy ống dẫn trứng bò có thể đóng vai trò quyết định trong quá trình hoạt hóa tinh
trùng bằng việc cung cấp một môi trường có chức năng thúc đẩy cả quá trình hoạt hóa và thụ tinh. Có chứng cứ cho rằng các tế bào ống dẫn trứng bò phân tiết các yếu tố mà các yếu tố đó có khả năng hỗ trợ và duy trì hoạt lực và khả năng sống của tinh trùng đến 30 h trong ống nghiệm (theo Ijaz và cs., 1994).
Hiện nay có nhiều phương pháp hoạt hóa tinh trùng nhân tạo được nhiều tác giả nghiên cứu, nhằm kích thích các quá trình xảy ra trong ống nghiệm cũng tương tự như trong đường sinh dục bò cái.
- Phương pháp thay đổi áp suất thẩm thấu và pH của môi trường: Sử dụng môi trường ưu trương (hypertonic) có áp suất thẩm thấu 380 mosm. (Brackett và Oliphant, 1975). Song Bondioli và Wright. (1983) lại sử dụng áp suất thẩm thấu 290 mosm cũng có hiệu quả tương tự, dựa vào sự xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng. Tinh trùng được ủ trong tủ ấm 14 - 18 h ở nhiệt độ 20o C, được rửa một lần để loại bỏ giảm các yếu tố bên ngoài, thay đổi màng tinh thanh và cho vào môi trường đẳng trương để trong tủ ấm 8 h.
- Phương pháp sử dụng Albumin huyết thanh bò và dịch nang trứng: Tinh trùng bò được tiếp xúc với huyết thanh bò trong một dung dịch muối sinh lý phù hợp có thể hoạt hóa trong ống nghiệm và huyết thanh bò cũng được sử dụng thường xuyên trong môi trường nuôi dùng trong TTON. Theo Downs và Bavister (1989), cho thấy albumin huyết thanh bò có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc loại bỏ cholesterol và kẽm (2 chất ổn định màng tế bào) khỏi màng tế bào tinh trùng khi hoạt hóa.
- Phương pháp dùng canxi ionophore (A23187): Đây là phương pháp giúp tinh trùng vượt qua giai đoạn đầu của quá trình hoạt hóa bằng cách tăng trực tiếp lượng Ca của tế bào và gây phản ứng (Hanada, 1985). Xử lý bằng ionophore cũng làm tăng hoạt động hô hấp của tinh trùng bò.
- Sử dụng Heparin và các loại glycosaminoglycan khác, trong đó sử dụng Heparin là phương pháp được chú ý nhất.