4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
1.6.1. Nuôi thành thục tế bào trứng in vitro
Để đảm bảo cho quá trình thụ tinh, tế bào trứng sau khi được hút ra bằng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng được soi tìm, đánh giá và phân loại. Các tế bào trứng loại A, B được đưa vào nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm và tạo phôi in vitro.
Edward. (1965) lần đầu đầu tiên thấy các tế bào trứng nguyên thủy của bò thu được từ các nang trứng không rụng trứng có thể tiếp tục phân bào giảm nhiễm và phát triển hoàn toàn đến giai đoạn pha giữa I của thời kỳ phân bào
in vitro. Nghiên cứu của Sirard và cs. (1988) về nuôi thành thục tế bào trứng
được hút từ các nang trứng bò ở giai đoạn phát triển mà không biết giai đoạn nào của chu kỳ có thể thành thục và thụ tinh in vitro để tạo ra thế hệ đời con.
Với khả năng phát triển của các kỹ thuật nuôi thành thục in vitro cho thấy, tế bào trứng thành thục trong thực tế là một quá trình phức tạp bao gồm sự thành thục của nhân và tế bào chất. Khả năng một tế bào trứng phục hồi lại quá trình phân bào giảm nhiễm và phát triển đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào không nói lên khả năng thụ tinh hay khả năng phát triển của tế bào trứng đó. Có nghĩa sự thành thục của nhân và tế bào chất thực tế là hai quá trình riêng biệt. Sự thành thục của tế bào chất trong thực tế cho thấy bao gồm nhiều sự kiện sinh lý và sinh học có thể liên quan hoặc không liên quan đến sự thành thục của nhân, nhưng có sự ảnh hưởng đáng kể sự thụ tinh và phát triển của phôi (Hunter, 1985). Sự thành thục không hoàn toàn của tế bào chất thực sự là nguyên nhân làm giảm khả năng phát triển khi sản xuất phôi động vật có vú.
Tế bào trứng của động vật có vú ở giai đoạn túi mầm sẽ được phân bào giảm nhiễm, túi mầm bị hỏng khi cho vào môi trường biến động. Huyết thanh, các gonadotropin như LH, FSH có sự ảnh hưởng tích cực đến sự thành thục của tế bào trứng, sự dãn nở của màng cumulus và sự thụ tinh của tế bào trứng. FSH và LH không ảnh hưởng đến tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn phân bào II sau 24h nhưng làm tăng tỉ lệ thành thục của nhân khi thiếu hụt huyết thanh. Các tế bào trứng phát triển đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào sau khi thành thục 16 h có khả năng phát triển cao hơn các tế bào trứng phát triển đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào ở thời gian thành thục 20 hay 24h.
Sự thành công khi nuôi thành thục tế bào trứng phụ thuộc vào sự nguyên vẹn của các tế bào cumulus. Các tế bào cumulus cung cấp năng lượng cho tế bào trứng như các amino acid, pyruvat và lactate (Sirard và cs., 1988).
Ngoài ra, tế bào cumulus bảo vệ sự xơ cứng của màng vòng trong suốt. Chỉ có các tế bào trứng có vài lớp màng cumulus nguyên vẹn trở lên mới được lựa chọn để nuôi thành thục, sự phát triển của phôi sau này liên quan đến số lượng màng cumulus bao quanh tế bào trứng. Sau khi nuôi thành thục các tế bào cumulus phát triển thành một khối hình cầu và khối tế bào cumulus dường như nổi lên trong đĩa nuôi phôi (Hensleigh và Hunter, 1983).
Sự có mặt của các tế bào hạt làm tăng sự thành thục, sự khả năng thụ tinh và khả năng phát triển của tế bào trứng bò (Fukui và Ono, 1989). Vì vậy một số tác giả đã bổ sung vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng tế bào hạt nhằm tạo môi trường nuôi in vitro giống với môi trường in vivo. Có nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, mức độ phôi dâu và phôi nang thu được nhiều khi nuôi thành thục tế bào trứng trong môi trường có các tế bào hạt (Edward và cs., 1997).
Nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở nước ta cho thấy, sự thành thục tế bào trứng bò in vitro được nâng lên khi nuôi với các yếu tố phát triển nhất định. Bổ sung yếu tố phát triển biểu bì vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng bò, huyết thanh hay các gonadotropin làm tăng khả năng kích thích sự phân bào và tăng đáng kể tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào, màng cumulus giãn nở, tỉ lệ thụ tinh và sự phát triển của phôi. Sự thành thục của tế bào trứng bò với yếu tố phát triển biểu bì I cũng làm tăng tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào, nhưng không làm ảnh hưởng đến sự giãn nở của các tế bào cumulus. Sự thành thục của tế bào trứng với yếu tố phát triển biểu bì α cũng kích thích sự giãn nở của tế bào cumulus và khả năng thụ tinh của tế bào trứng thành thục. Hormone sinh trưởng làm tăng sự thụ tinh của tế bào trứng bò. Yếu tố phát triển giống insulin B, yếu tố sinh trưởng biến đổi β1 không làm ảnh hưởng đến sự giãn nở của màng cumulus.
Quá trình thành thục của nhân ở tế bào trứng bắt đầu từ sự phân rã của túi mầm. Sau khi túi mầm phân rã, sự phân bào giảm nhiễm của tế bào trứng được hồi phục và phát triển qua giai đoạn pha giữa của giai phân bào I, kỳ sau của phân bào I và kỳ cuối của phân bào I, dẫn đến sự xuất hiện của thể cực thứ nhất. Tế bào trứng sau đó lại ngừng lại ở giai đoạn pha giữa của phân bào giảm nhiễm II. Ở giai đoạn pha giữa của phân bào giảm nhiễm II, các tế bào trứng sẵn sàng cho quá trình thụ tinh.
Hầu hết các tác giả nuôi tế bào trứng thành thục trong môi trường TCM-199 với 5 hoặc 10 % huyết thanh bê mới sinh, sodium pyruvate (0,2 mM) FSH, LH và estradiol 17β (0,1µg/ml), kháng sinh 100.000 iu penicillin/ml và streptomycin 100 µg (Bavister, 1996; Saitoh và cs., 1995). Sau khi được rửa sạch trong môi trường TCM-199, 20 tế bào trứng được nuôi/giọt được nuôi thành thục trong thời gian 20 h trong các môi trường trên, với, nhiệt độ 38,50
C, CO2 5%, pH khoảng 7,3 - 7,4 và độ ẩm tối đa. Các giọt nuôi phôi được phủ dầu khoáng.