vận chuyển lipit
Phân lập gen là một công cụ hữu hiệu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bước khởi đầu cho các kỹ thuật tiếp theo. Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên, ADN ngoại lai được nối vào một vectơ nhằm tạo ra ADN tái tổ hợp. Vectơ sử dụng là plasmid thích ứng của vi khuẩn E.Coli. Sau đó, vectơ tái tổ
hợp được biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để nhân vi khuẩn nhiều lần. Cuối cùng qua bước tách chiết ADN, người ta sẽ thu được một lượng lớn plasmid tái tổ hợp [2], [148].
thay đổi, nhưng tiến trình tách dòng nói chung được thực hiện qua bốn bước: xử lý ADN cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế
bào chủ, chọn dòng [3], [10], [148].
Kỹ thuật phân lập gen được sử dụng trong các nghiên cứu về cấu trúc gen, các cơ chế phân tử liên quan đến đặc tính chống chịu ở thực vật và phục vụ cho việc chuyển các gen mong muốn vào cây trồng [2], [3], [29], [34]. Nhiều gen quý có giá trịứng dụng như năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu đã được phân lập và nghiên cứu nhằm chuyển vào cây trồng để tạo cây chuyển gen mang tính trạng mong muốn. Các nghiên cứu đã tiến hành thu thập và phân lập được nhiều nguồn gen quý có giá trị trong nông nghiệp như
gen chịu mặn, chịu lạnh ở lúa [3], [4], gen mã hóa protein bất hoạt hoá ribosom (RIP) ở cây mướp đắng (Momordica charantia) và gen mã hoá α - amylase của cây đậu cô ve (Phaseolus vulgaris) có hoạt tính diệt côn trùng; gen kháng bọ hà khoai lang của vi khuẩn Bt; gen mã hoá protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ (Carica papaya), gen chịu hạn và chống sâu vào cây bông gòn (Ceiba pentandra)... Hiện các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu để thực hiện chuyển gen vào cây lúa, cây hoa, cây bông và cây lâm nghiệp, nhằm nâng cao sức chống chịu với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi [2], [3], [21].
Đặc tính chịu hạn nói riêng và tính chống chịu nói chung ở thực vật được hình thành trong quá trình tiến hoá dưới tác động của chọn lọc tự nhiên. Nghiên cứu tính chống chịu về mặt sinh lý, hoá sinh và cấu trúc tế bào cho thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở những mức độ khác nhau, trong các giai đoạn phát triển khác nhau. Điều này chứng tỏ tính chống chịu của thực vật do nhiều gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây trồng. Cho đến nay vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính
chịu hạn của cây trồng, một trong các gen đó là gen mã hóa protein vận chuyển lipit (Lipid transfer proteins gene).
Lipid transfer proteins (LTP) là một nhóm protein có số lượng lớn trong thực vật bậc cao (chiếm tới 4% tổng số protein hoà tan). Ở thực vật, chúng không chỉ tham gia vào sự hình thành lớp cutin - có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ mô thực vật tránh khỏi sự mất nước và quá trình phát sinh phôi, chúng còn tham gia các phản ứng chống lại tác nhân gây bệnh ở thực vật và quá trình thích nghi của cây đối với các điều kiện khác nhau của môi trường sống [100]. Protein vận chuyển lipit ở thực vật (LTP) là các protein nhỏ, liên kết với lipit và rất phong phú, chúng có khả năng trao đổi lipit giữa các màng trong thực nghiệm. LTP chủ yếu vận chuyển lipit dựa trên vị trí ở ngoại bào của chúng. Một số vai trò sinh học khác bao gồm: tính kháng khuẩn, tín hiệu, và nới lỏng thành tế bào đã được đề xuất, nhưng vẫn còn thiếu bằng chứng để
kết luận, và các chức năng này cũng không tương quan với cấu trúc hay hoạt
động của LTP trong ống nghiệm [169].
Gen mã hoá LTP lần đầu tiên được Tchang và đtg phân lập từ mARN và
đọc trình tự cADN ở cây ngô vào năm 1988 [165], sau đó là nhiều trình tự
trên các đối tượng khác nhau được công bố như ở cà chua (Torres và đtg,
1992), Arabidopsis thaliana (Thoma và đtg, 1994), thuốc lá (Masuta và đtg, 1992), củ cải đường (Kristensen và đtg, 2000), cây đậu xanh (Nguyễn Vũ
Thanh Thanh và đtg, 2009; Chu Hoàng Mậu và đtg, 2009).
Gen mã hóa LTP thuộc họ gen pathogenesis - relate, có khả năng tổng hợp protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipit tới màng. LTP còn hỗ
trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp
ứng lại những thay đổi của môi trường [100]. Gen LTP được phát hiện có nhiều ở trong lá, các tế bào giữa các bó mạch và ở đỉnh ngọn mà ít thấy ở rễ
Để nghiên cứu sự phức tạp, sự tiến hóa và sự biểu hiện của họ gen LTP, Vignols F. và đtg (1997) đã phân lập một số gen LTP mã hóa ba loại protein LTP ở lúa. Khối lượng phân tử protein của ba gen LTP đã phân lập được ở
lúa là 9 kDa cũng tương đương so với khối lượng phân tử của protein LTP ở
các thực vật khác. Tuy nhiên, sự biểu hiện gen LTP khác nhau tùy thuộc vào mô cây. Các thành phần như muối, axit salixilic và axit abxisic biến động tùy theo sự biểu hiện của gen LTP và tùy thuộc vào các mô và các nhóm gen LTP, điều này cho thấy sự phức tạp của các gen LTP [173].
Nghiên cứu gen LTP được tách chiết từ hạt vừng non cho thấy, các gen LTP rất phong phú trong hạt vừng non là có liên quan đến việc chuyển lipit vào dịch bào [65]. Peter và đtg (1991) dựa trên vị trí protein EP2 (extracellular protein 2) và trình tự gen của gen EP2 ở cây cà rốt đã đề xuất vai trò của protein vận chuyển lipit ở thực vật (LTP) là vận chuyển các đơn phân tử cutin qua lớp chất nguyên sinh tới các điểm tổng hợp cutin [136]. Arondel V. và đtg (2000) đã nghiên cứu đặc điểm của họ gen LTP ở
Arabidopsis thaliana, trong số 15 gen LTP được phân lập thì đã xác định vị
trí trên các nhiễm sắc thể và đặc điểm biểu hiện của 6 gen LTP, tạo cơ sở cho việc thực hiện tiếp cận di truyền để xác định chức năng của các protein này [54]. Suelves và đtg (1997) cũng thấy có sự khác biệt giữa mARN mã hóa LTP trong các bộ phận của hoa và quả non ở cây anh đào (Prunus amygdalus), chứng tỏ gen LTP ở cây anh đào chỉ là một phân họ khác biệt trong họ gen LTP [158].
Nghiên cứu của Blilou I. và đtg (2000) đã cho thấy, sự biểu hiện của gen LTP là để phản ứng với trạng thái bị nhiễm nấm Glomus mosseae của rễ lúa. Tốc độ phiên mã của gen LTP tăng dần cùng với sự gia tăng mức độ xâm nhập của nấm qua lớp biểu bì rễ lúa, sau đó giảm dần khi nấm đã xâm nhập vào vỏ rễ. Đồng thời, Blilou I. và đtg cũng thấy có mối quan hệ trong biểu
hiện gen LTP và gen Pal (phenylalanine ammonia-lyase) điều này chứng tỏ
hai gen này có liên quan đến tính chống chịu của cây [61]. Sự gia tăng biểu hiện của gen LTP khi cây bị nhiễm virus cũng được xác nhận trong nghiên cứu của Awinder và đtg (1999) ở cây cải dại (Arabidopsis thaliana) [58]. Kết quả phân lập và nghiên cứu đặc điểm gen LTP từ cây lúa mạch đen cho thấy, có sự gia tăng biểu hiện gen LTP trong lớp tế bào giữa các bó mạch lá và thân của những cây lúa mạch bị xử lý hạn so với những cây ở điều kiện đủ nước. Trong khi đó, mức độ biểu hiện gen LTP không có thay đổi đáng kể khi xử lý lạnh và axit abxisic trong 24 giờ. Điều đó chứng tỏ vai trò của LTP trong các phản ứng chống chịu hạn của lúa mạch [97]. Sarowar S. và đtg (2009) cũng nhận định là sự biểu hiện cao của gen LTP đã góp phần tăng cường tính kháng bệnh của cây thuốc lá, LTP còn đóng một vai trò quan trọng như là hệ thống tín hiệu từ xa để kích hoạt các phản ứng chống chịu trong cây [150].
Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro các phân tử xellulose xyloglucan của thành tế bào thực vật có thể được gây ra bởi các LTP, mặc dù chưa có bằng chứng in vivo song khám phá này chắc chắn sẽ đem lại các câu hỏi thú vị về cơ chế mở rộng thành tế bào thực vật [127]. Những phân tử
protein do gen LTP tổng hợp thường có đặc điểm chung là: điểm đẳng điện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa, và với sự có mặt của 8 phân tử
cystein làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfit [167]. Khi gặp những điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP hoạt động tổng hợp protein và tăng cường vận chuyển phospholipit tới màng, tăng tính bền vững của thành tế bào và khả năng giữ nước của màng nhằm giúp cho cây chống được stress hạn.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU