- Xác định hàm lượng prolin: Phân tích hàm lượng prolin theo phương pháp của Bates và đtg [59].
2.2.4.3. Các phương pháp phân lập gen Phương pháp nhân dòng gen bằng PCR
Phương pháp nhân dòng gen bằng PCR
kế dựa trên trình tự cADN phân lập từ giống lúa Yukihikari (Nhật Bản) được công bố bởi Mukai và đtg (2003) ở GenBank với mã số AY466108 [124]. Cặp mồi được tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự cặp mồi là:
LTPrF: 5’ ATGGCCGGCAAGAAGGTGC 3’ LTPrR: 5’ TTAGAGAGGGCAGGTGAAGTC 3’
Thành phần của phản ứng nhân gen LTP được trình bày trong bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng là: 940C trong 3 phút; 30 chu kỳ với các mức nhiệt độ và thời gian: 940 C trong 30 giây, 560 C trong 1 phút, 720 C trong 1 phút; 720 C trong 10 phút và lưu giữ mẫu ở 40 C. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen LTP STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O khử ion 12,5 2 Buffer PCR 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2 5 Mồi xuôi (10pM/µl) 2 6 Mồi ngược (10pM/µl) 2 7 ADN (10ng/µl) 1,0
8 Taq - polymerase (0,5 unit/µl) 0,5
Tổng 25,0
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel bằng ethidium bromide, rửa bằng nước, sol gel và chụp ảnh.
Tạo plasmid tái tổ hợp và biến nạp
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ hoá chất DNA Gel Extraction và được dòng hoá vào vector pBT DHα sử dụng bộ kit Rapid DNA Ligation. Sau khi biến nạp vào tế bào khả biến, chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp
chỉ thị màu và kháng sinh. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi pUC 18.
Tách plasmid
Sản phẩm chọn dòng được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi pUC18 và được tách plasmid bằng bộ kít GeneJET™ Plasmid Miniprep theo các bước sau:
1) Lấy 1,5 ml dịch khuẩn vào ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 3.000 vòng / phút trong 7 phút, thu cặn.
2) Lần lượt bổ sung các dung dịch, đồng thời thực hiện các thao tác kèm theo là:
- 250 µl Resuspension solution, vortex - 250 µl Lysis solution, đảo nhẹ 4-6 lần - 350 µl Neutralization, đảo nhẹ 4-6 lần Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút
3) Hút dịch trong chuyển vào cột lọc, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch.
4) Thêm 500 µl Wash solution, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch (lặp lại 2 lần).
Ly tâm lại cặn trong cột với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 1 phút.
5) Chuyển cột sang ống eppendorf mới, thêm 50 µl nước và để trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 2 phút và thu dịch.
Xác định trình tự nucleotit
Trình tự gen LTP được đọc trên thiết bị tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer theo nguyên lý của Sanger với bộ kit BigDye Terminator v. 3.2 Cycle Sequencing.
- Phương pháp điện di ADN trên gel agarose [148].