- Xác định hàm lượng prolin: Phân tích hàm lượng prolin theo phương pháp của Bates và đtg [59].
3.2.1.Kết quả xác định quan hệ di truyền của 25 giống lúa cạn nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD
KL lá tươ
3.2.1.Kết quả xác định quan hệ di truyền của 25 giống lúa cạn nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD
cứu bằng kỹ thuật RAPD
Sự đa dạng của cây lúa không những biểu hiện ở các tính trạng hình thái, đặc điểm phả hệ mà còn biểu hiện ở các dữ liệu ADN trong cấu trúc hệ
gen của chúng (Fuentes và đtg, 2005) [82]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm hệ gen nhằm xác định quan hệ di truyền của 25 giống lúa cạn đã
được phân loại về khả năng chống chịu theo các chỉ tiêu sinh lý bằng kỹ thuật RAPD.
Sau khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD, các sản phẩm được điện di trên gel agarose 2% và chụp ảnh để phân tích sự đa hình ADN của các giống lúa cạn nghiên cứu (hình 3.2 và hình 3.3). Khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên, phân tích số liệu theo qui ước: 1 = phân đoạn ADN xuất hiện và 0 = phân đoạn ADN không xuất hiện.
Với 25 giống lúa cạn nghiên cứu và sử dụng 20 trình tự mồi ngẫu nhiên, số phản ứng mà chúng tôi đã thực hiện là 500 phản ứng và tổng cộng có 2431 phân đoạn ADN được nhân bản. Kết quả thống kê tổng số phân đoạn ADN và tỷ lệ số phân đoạn đơn hình và đa hình của từng mồi được trình bày
ở bảng 3.9.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M7
(M-marker, 1- Mt, 2- Klk, 3- Kk, 4- Blt, 5- Ln, 6- Bcc, 7- Km, 8- Ltn, 9- Blx, 10- Kp, 11- Kpl, 12- Kx, 13- Kld, 14- Nn, 15- Nro, 16- Lo, 17- Bct, 18- Bcs, 19- Kt, 20- Bic, 21- Ss, 22-
Kn, 23- Md, 24- Bsn, 25- Gb)
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M20
(M-marker, 1- Mt, 2- Klk, 3- Kk, 4- Blt, 5- Ln, 6- Bcc, 7- Km, 8- Ltn, 9- Blx, 10- Kp, 11- Kpl, 12- Kx, 13- Kld, 14- Nn, 15- Nro, 16- Lo, 17- Bct, 18- Bcs, 19- Kt, 20- Bic, 21- Ss, 22-
Bảng 3.9. Tổng số phân đoạn ADN và tỷ lệ số phân đoạn ADN đa hình của 20 mồi RAPD
TT Mồi Tổng số phân đoạn ADN Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) 1 M1 15 10 5 66,67 2 M2 10 6 4 60,00 3 M3 6 3 3 50,00 4 M4 12 7 5 58,33 5 M5 9 8 1 88,89 6 M6 11 11 0 100,00 7 M7 14 8 6 57,14 8 M8 8 5 3 62,50 9 M9 9 8 1 88,89 10 M10 5 2 3 40,00 11 M11 2 0 2 0,00 12 M12 0 0 0 0,00 13 M13 9 9 0 100,00 14 M14 4 1 3 25,00 15 M15 5 2 3 40,00 16 M16 8 7 1 87,50 17 M17 7 6 1 85,71 18 M19 7 6 1 85,71 19 M20 10 9 1 90,00 20 TRA4 7 2 5 28,57 Tổng 158 110 48 69,62
Bảng 3.9 cho thấy trong 20 mồi RAPD sử dụng phân tích tính đa hình của 25 giống lúa thì mồi M12 không có phân đoạn ADN nào được nhân bản, các mồi còn lại đều có số lượng phân đoạn ADN dao động từ 2 đến 15.
Tổng số phân đoạn ADN của 25 giống lúa cạn khi phân tích với 20 mồi ngẫu nhiên là 158 phân đoạn. Trong đó số phân đoạn đa hình là 110 phân
đoạn (chiếm 69,62 %) và số phân đoạn không đa hình là 48 phân đoạn (30,38%).
Trong 25 mồi dùng trong nghiên cứu có hai mồi là M6 và M13 cho tính
đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với tỷ lệ đa hình cao nhất đạt 100%, mồi M11 không xuất hiện băng đa hình và cũng là mồi có số lượng phân đoạn ADN được nhân bản ít nhất do vậy tỷ lệ đa hình là 0 %, các mồi còn lại đều nhận được sự đa hình các phân đoạn ADN với các tỷ lệ khác nhau (bảng 3.9). Các mồi nghiên cứu được thiết kế dựa trên sự sai khác của các trình tự nucleotit vì vậy từ kết quả đa hình và đơn hình các phân đoạn ADN cho thấy đã xuất hiện sự sai khác về ADN của 25 giống lúa cạn trong nghiên cứu này.
Các số liệu phân tích PCR-RAPD được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các giống lúa cạn nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ
hình cây. Chỉ số đa dạng di truyền (HRAPD) xác định dựa trên các phân đoạn ADN được nhân bản trong phản ứng RAPD ở 158 locus là 47,46%.
Dựa trên kết quả phân tích đa hình ADN, chúng tôi đã xác định mối quan hệ và khoảng cách di truyền của các giống lúa nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Sơđồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 25 giống lúa cạn II III IV V VI Hệ số giống nhau
Hình 3.4 cho thấy các giống lúa được chia làm hai nhánh chính với khoảng cách di truyền là 21% (1 - 0,79). Nhánh chính thứ nhất chia làm hai nhóm I và II. Nhóm I chỉ có một giống Mt, nhóm II gồm 10 giống (Klk, Bic, Km, Blx, Kx, Kld, Kk, Blt, Kp, Kpl), hai nhóm I và II có khoảng cách di truyền là 20% (1- 0,8).
Nhánh chính thứ hai có 14 giống và được chi thành hai nhánh phụ. Nhánh phụ thứ nhất có 3 nhóm: nhóm III gồm hai giống Ln và Bsn, nhóm IV gồm 10 giống, (Bcc, Bct, Ltn, Bcs, Kt, Nro, Lo, Ss, Kn, Kd), trong đó hai giống lúa Bcc và Bct có khoảng cách di truyền thấp nhất (8%); nhóm V chỉ có một giống là Md. Nhánh phụ thứ hai có hai giống Gb và Nn thuộc nhóm VI, có khoảng cách di truyền với nhánh phụ thứ nhất là 18,75% (1 – 0,8125).
Kết quả nghiên cứu về sự thay đổi cấu trúc hệ gen giữa các quần thể lúa dại Oryza rufipogon ở Trung Quốc và Brazil ở mức độ phân tử ADN bằng kỹ
thuật RAPD với 60 mồi ngẫu nhiên, Song và đtg (1999) cho rằng, các giống lúa ở cùng khu vực thì có hệ số đa dạng di truyền thường thấp hơn (khoảng 14,9 – 23%) so với những giống ở những châu lục khác nhau (đạt 61,8%) [157]. Các giống lúa cạn mà chúng tôi phân tích có cùng nguồn gốc thuộc các
địa phương miền núi phía Bắc Việt Nam, có khoảng cách di truyền từ 8% - 21% hoàn toàn phù hợp với nhận định vừa nêu của Song và đtg [157].
Bảng 3.10 trình bày các chỉ thị phân tử RAPD cho một số giống lúa cạn. Các giống lúa Bcs, Gb, Kn, Ln, Md, Mt, Nn thuộc nhóm chịu hạn tốt. Giống Bcs có một chỉ thị phân tử 800 bp-M20, giống Gb có hai chỉ thị 900 bp-M3 và 1500 bp-M15, giống Kn có một chỉ thị 400 bp-M6, giống Ln có một chỉ thị 750 bp-M17, giống Md có hai chỉ thị 500 bp-M3 và 1100 bp-M6, giống Mt có một chỉ thị 1400 bp-M1, giống Nn có một chỉ thị 350 bp-M20. Các giống Blx, Kk, Km, Kpl, Nro thuộc nhóm chịu hạn kém. Giống Blx có một chỉ thị 350 bp-M16, giống Kk có chỉ thị 1250 bp-M9 và 900 bp-M9,
giống Km có chỉ thị 400 bp-M5, 650 bp-M5 và 1300 bp-M5, giống Kpl có hai chỉ thị 900 bp-M13 và 650 bp-M20.
Bảng 3.10. Các phân đoạn ADN đặc trưng của các giống lúa cạn với các mồi ngẫu nhiên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giống Vị trí phân đoạn ADN đặc trưng của từng mồi (bp)
M1 M3 M5 M6 M9 M13 M15 M16 M17 M20 Bcs - - 550 - - - 800 Blx - - - 350 - - Gb - 900 - - - - 1500 - - - Kk - - - - 1250; 900 - - - - - Km - - 400; 650; 1300 - - - - Kn - - - 400 - - - - Kpl - - - 900 - - - 650 Ln - - - 750 - Md - 500 - 1100 - - - - Mt 1400 - - - - Nn - - - 450 Nro - - - 350
Khả năng chịu mất nước của cây lúa là tính trạng đa gen và thực tế có nhiều gen liên quan đến đặc tính chịu hạn. Từ kết quả so sánh các phân đoạn
ADN đặc trưng của các giống lúa giữa hai nhóm chịu mất tốt và chịu mất kém có thể giả thiết về sự liên kết giữa chỉ thị phân tử RAPD ở trên với đặc tính chịu hạn của cây lúa cạn và đồng thời các chỉ thị phân tử này cũng là cơ sởđể
nhận dạng các giống lúa cạn nghiên cứu.
Như vậy, các giống lúa cạn nghiên cứu có sự đa dạng về hệ gen. Kết hợp kết quả đánh giá tính chịu mất nước theo các chỉ tiêu sinh lý và phân tích RAPD bước đầu cho thấy, việc xác định cây phân nhóm quan hệ di truyền của 25 giống lúa cạn nghiên cứu đã chứng minh sự khác biệt về mặt di truyền của giống chống chịu tốt nhất là giống Gb và giống chống chịu kém nhất là giống Klk (đã được xác định theo các chỉ tiêu sinh lý) thuộc hai nhánh hoàn toàn khác nhau. Các giống lúa cạn có tính chống chịu mất nước kém có khoảng cách di truyền tương đối xa với các giống chống chịu tốt. Điều này chứng tỏ, sự sai khác về đặc điểm ADN hệ gen của các giống lúa nghiên cứu là cơ sở
cho sự khác nhau của các chỉ tiêu sinh lý về khả năng chịu mất nước.
Để minh chứng thêm về sự khác biệt di truyền của giống lúa chịu mất nước tốt nhất (Gb) và kém nhất (Klk) mà đã được xác định theo các chỉ tiêu sinh lý và quan hệ di truyền qua cây phả hệ (hình 3.4), chúng tôi tiếp tục phân tích so sánh trình tự gen mã hóa protein vận chuyển lipit (LTP) – là một loại protein liên quan đến khả năng chống chịu hạn của cây.