Chuẩn bị môi trường:

+ Môi trường cân bằng (ES) và môi trường thủy tinh hóa (VS) được chuẩn bị khoảng 30 phút trước khi sử dụng và giữ ở nhiệt độ phòng (25 – 27o

C). 1 1 2 3 1 2 3

42

+ Ghi nhãn ES, VS1, VS2 lên nắp đĩa repro, giếng ES chứa 300 l môi trường cân bằng, giếng VS1 và VS2 mỗi giếng chứa 300 l môi trường thủy tinh hóa (Hình 2.3).

- Cân bằng thẩm thấu

Đặt phôi vào môi trường cân bằng.

Ngay sau khi tiếp xúc với môi trường cân bằng, thể tích phôi sẽ giảm đi nhanh chóng do hiện tượng mất nước và từ từ trở về trạng thái ban đầu. Yêu cầu của quá trình này là thể tích phôi phải được phục hồi lại hoàn toàn. Quá trình cân bằng thẩm thấu có thể hoàn thành khi phôi trở về trạng thái như trước khi tiến hành khử nước.

- Thuỷ tinh hoá

Sau khi hoàn thành bước cân bằng, chuyển phôi sang giếng VS1, sau 60 giây, chuyển phôi sang giếng VS2, lúc này thể tích phôi sẽ giảm thêm lần nữa, phôi bị co rút lại. Nhanh chóng đặt phôi lên phần đầu của dụng cụ chứa phôi với lượng rất ít môi trường thủy tinh hóa, và nhúng dụng cụ chứa phôi trực tiếp vào nitơ lỏng, toàn bộ quá trình diễn ra trong vòng 30 giây.

43 - Lưu trữ

Sau khi đậy phần đầu của dụng cụ chứa phôi lại, cho dụng cụ chứa phôi vào hộp đựng dụng cụ chứa phôi đã ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và cất vào thùng ni tơ lỏng.

* Quy trình rã đông

- Chuẩn bị môi trường rã đông (Hình 2.4)

Hình 2.4. Chuẩn bị môi trường rã đông

+ Môi trường rã đông (TS) được chuẩn bị trong đĩa petri đường kính 35mm.

+ Môi trường hòa tan (DS), môi trường rửa (WS) lần lượt được cho vào các giếng DS, WS1, WS2 của đĩa repro, mỗi giếng chứa 300l môi trường.

+ Môi trường rã đông được làm ấm đến 370C trong thời gian ít nhất là 1,5 giờ. Các môi trường còn lại được làm ấm đến nhiệt độ phòng (25 - 270

C).

- Rã đông phôi

+ Phần đầu của dụng cụ chứa phôi đang đặt trong nitơ lỏng, được nhúng trực tiếp vào môi trường rã đông. Phôi sẽ rơi khỏi dụng cụ chứa vào trong môi trường.

44

Hình 2.5. Quy trình đông lạnh và rã đông phôi.

- Pha loãng

+ Phôi được để trong môi trường hòa tan trong 3 phút, ở đây nồng độ của chất bảo quản bên trong phôi sẽ được hòa loãng, hình dạng của phôi dần được phục hồi.

- Giai đoạn rửa

+ Từ môi trường hòa tan, phôi lần lượt được chuyển sang WS1 trong 5 phút và WS2 trong 1 phút, trong giai đoạn này phôi sẽ được khôi phục lại hoàn toàn hình thái như trước khi trữ lạnh, chất bảo quản lạnh trong phôi được kéo hết ra môi trường.

+ Sau đó, phôi được chuyển sang môi trường nuôi cấy và ủ ở nhiệt độ 37oC, 6% CO2 để nuôi cấy đến khi chuyển phôi.

1 phút 0,5 phút 12 – 15 phút 23.000oC/phút TS 42.000oC/phút 1 phút, 37oC 1 phút 5 phút 3 phút

Phôi ở các giai đoạn phát triển khác nhau

45

2.2.3.3. Phương pháp hỗ trợ thoát màng phôi bằng acid tyrode.

Phôi sau khi rã đông, nuôi cấy qua đêm, trước khi chuyển phôi 2 giờ sẽ thực hiện kỹ thuật hỗ trợ thoát màng. Dùng pipette giữ phôi ở vị trí 9 giờ và một pipette chứa dung dịch acid Tyrode được đưa vào vị trí 3 giờ vùng có khoang quanh phôi trống. Một vùng khiếm khuyết trên màng trong suốt bị mỏng đi 50% độ dầy được tạo ra bằng cách thổi acid tyrode trên bề mặt ngoài của màng trong suốt. Phôi được rửa vài lần để loại bỏ lượng acid tyrode thừa và được đặt trong môi trường nuôi cấy chờ cho đến lúc chuyển phôi.

2.2.3.4. Phương pháp làm tiêu bản cho kính hiển vi điện tử truyền qua.

Tiến hành làm tiêu bản cho kính hiển vi điện tử truyền qua gồm các bước dưới đây theo Nguyễn Kim Giao (2004) [2]:

+ Bước 1: Vật phẩm được cố định trong dung dịch glutaraldehyt 4% trong dung dịch đệm cacodylat thời gian 5 giờ ở 4o

C.

+ Bước 2: Rửa bằng dung dịch đệm cacodylat một lần sau đó cố định mẫu trong dung dịch cacodylat để qua đêm ở nhiệt độ 4o

C.

+ Bước 3: Thấm khô mẫu vật và cố định trong dung dịch osmic 1% trong 60 phút.

+ Bước 4: Rửa bằng dung dịch đệm 3 lần mỗi lần 2-3 phút.

+ Bước 5: Rửa nước bằng cồn có nồng độ từ thấp đến cao theo thứ tự Cồn 30o trong 30 phút. Cồn 40o trong 30 phút. Cồn 70o trong 30 phút. Cồn 90o trong 30 phút. Cồn 100o lần 1 trong 30 phút. Cồn 100o lần 2 trong 30 phút. Cồn 100o lần 3 trong 1 giờ.

+ Bước 6: Chuyển mẫu vật qua cồn + Propylen oxyt tỷ lệ 1/15. + Bước 7: Để mẫu vật ở propylen oxyt trong 15 phút.

46

+ Bước 9 : Cho mẫu vật vào hỗn dịch đúc để ở nhiệt độ phòng thời gian 24 giờ. + Bước 10 : Cho mẫu vật vào khuôn đúc, đổ hỗn dịch vào trong khuôn để trong tủ ấm 30oC thời gian 24 giờ, sau đó 45oC trong thời gian 24 giờ, sau đó lại 60o

C trong 72 giờ.

Các block được cắt lát siêu mỏng trên máy Ultramicrotom L.K.B.4, độ dày lát cắt 50 – 70nm. Mỗi block làm 3 tiêu bản.

Nhuộm tiêu bản bằng uranyl acetate 10% và citrat chì 4% .

Đọc tiêu bản trên kính hiển vi truyền qua JEOL - 1011 có độ phân giải 2Ao , điện áp 100KV, tại Labo kính hiển vi điện tử - Bộ môn Mô Phôi - Học viện Quân y.

2.2.3.5. Phương pháp làm tiêu bản cho kính hiển vi điện tử quét.

Các bước làm tiêu bản cho kính hiển vi điện tử quét theo Nguyễn Kim Giao (2004) [2]:

+ Bước 1: Làm sạch mặt mẫu bằng cách rửa qua dung dịch đệm 3 lần + Bước 2: Cố định mẫu