- Vật phẩm được cố định trong dung dịch glutaraldehyt 4% trong dung dịch đệm cacodylat thời gian 5 giờ ở
4.2.1.Hình thái phôi trước đông lạnh và sau rã đông quan sát dưới kính hiển vi quang học
A. Phôi tươi B Phôi sống nguyên vẹn sau rã đông
4.2.1.Hình thái phôi trước đông lạnh và sau rã đông quan sát dưới kính hiển vi quang học
vi quang học
* Độ dầy màng trong suốt và đường kính phôi trước đông lạnh và sau rã đông
Trong nghiên cứu, chúng tôi đã chụp ảnh tất cả các phôi trước đông lạnh và sau rã đông, đo độ dầy màng trong suốt và đường kính phôi cho tất cả 444 phôi, sau đó dùng test T không ghép cặp để so sánh trước đông lạnh và sau rã đông, kết quả cho thấy sự thay đổi cấu trúc hình thái phôi ngày 3, ngày 5 trước đông và sau rã đông về đường kính phôi, độ dầy màng trong suốt là không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Chúng tôi nghĩ rằng, đây là một minh chứng cho rằng qui trình làm lạnh và môi trường bảo quản mà chúng tôi đang sử dụng là ổn định, đáng tin cậy. Yi-Fan Gu và cộng sự đã nghiên cứu trên 103 phôi tươi và 123 phôi sau rã đông sử dụng quan sát màng trong suốt của phôi dưới kính hiển vi có ánh sáng phân cực cho thấy màng trong suốt có cấu trúc 3 lớp, tác giả đã đo độ dầy của từng lớp, đo độ dầy tổng của màng trong suốt của phôi trước đông lạnh, phôi sau rã đông kết quả cho thấy độ dầy từng lớp màng trong suốt của phôi trước đông lạnh và sau rã đông khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Độ dầy trung bình của màng trong suốt của phôi trước đông lạnh là 19,20 ± 2,52 µm và sau rã đông là 18,99 ± 2,48 µm, sự khác nhau về độ dầy màng trong suốt trung bình của phôi trước đông lạnh và sau rã đông không có ý nghĩa thống kê với p = 0,521 [42]. Tuy nhiên, chúng tôi đo được độ dầy màng trong suốt
107
trung bình của phôi ngày 3 là 14,7 ± 1,13 µm thấp hơn so với kết quả của Yi- Fan Gu đo được là 19,20 ± 2,52 µm. Chúng tôi cho rằng có thể phôi của người Việt nam có khác biệt về độ dầy màng trong suốt so với phôi người nước ngoài, cũng có thể do độ tuổi bệnh nhân nghiên cứu của Yi-Fan Gu khác biệt so với nghiên cứu của chúng tôi. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các tác giả như Sifer C.và cs. [86], Van Den Abbeel E [101] cho thấy độ dầy màng trong suốt của phôi trước đông lạnh và sau rã đông là không khác biệt. Kết quả này cũng chứng minh được ưu điểm của phương pháp thủy tinh hóa so với kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây là không gây tổn thương màng trong suốt trong quá trình làm lạnh và rã đông [13].
Kết quả của bảng 3.10, 3.15 cho thấy đường kính trung bình của phôi ngày 3, ngày 5 trước đông lạnh không thấy sự khác biệt so với đường kính phôi trung bình của ngày 3, ngày 5 sau rã đông với p > 0,05. Chúng tôi nghĩ rằng, đây là một minh chứng cho rằng qui trình làm lạnh và môi trường bảo quản mà chúng tôi đang sử dụng là ổn định, tin cậy. Sau khi nuôi cấy phôi qua đêm thấy đường kính phôi tăng lên có ý nghĩa thống kê so với đường kính phôi trung bình của phôi sau rã đông. Điều này chứng tỏ phôi vẫn tiếp tục phát triển sau rã đông. Như vậy, có thể nói quá trình đông lạnh và rã đông không ảnh hưởng tới kích thước của phôi. Kết quả này giúp cho việc ứng dụng trong labo có thể sử dụng pi-pet hút phôi cùng kích thước để thao tác cho các phôi trước đông lạnh và sau rã đông nhưng đối với phôi sau khi nuôi cấy thì phải dùng pi-pet có kích thước lớn hơn để tránh làm tổn thương phôi.
* Hình thái phôi trước đông lạnh và sau rã đông
Để đảm bảo cho phôi ít bị phơi nhiễm ngoài không khí, tất cả các phôi trước đông lạnh, sau rã đông chúng tôi đều chụp ảnh phôi dưới kính hiển vi quang học đảo ngược Olympus 70, độ phóng đại 200 lần. Hình thái cấu trúc của phôi được đánh giá bằng quan sát trên ảnh chụp.
108
- Đối với phôi đông lạnh ngày 3: Trong nghiên cứu, các phôi trước đông và sau rã đông đều được chia thành 4 độ dựa vào hình thái cấu trúc của phôi theo tiêu chuẩn đánh giá phôi của Andres Salumets (2001) [83]. Mặc dù bằng những nhận xét chủ quan nhưng lượng giá được số lượng tế bào của phôi, cấu trúc và sự sống của tế bào, đặc biệt là quan sát những mảnh vỡ bào tương, chúng tôi có thể đánh giá được độ phôi trước đông lạnh và sau rã đông. Cho đến nay, đánh giá chất lượng phôi chủ yếu dựa vào hình thái phôi bao gồm: số lượng tế bào, tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương và sự đồng đều giữa các phôi bào. Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng những phôi có chất lượng tốt, có số phôi bào đồng đều, có ít mảnh vỡ bào tương thì ít hoặc không bị thay đổi hình thái sau khi rã đông, những phôi có tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương càng cao thì tỷ lệ sống sau rã đông càng giảm [9], [24], [93]. Do đó, trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ chọn những phôi có chất lượng tốt, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương dưới 20% tương đương với phôi độ 3, độ 4 theo cách phân độ phôi của Andres Salumets (2001) [83]. Kết quả nghiên cứu cho thấy những phôi độ 4 sau rã đông còn nguyên vẹn 100%, phôi độ 3 sau rã đông chỉ còn nguyên vẹn là 80,8% do có 10 phôi độ 3 bị thoái hóa độ 1, có 7 phôi độ 3 bị thoái hóa độ 2, 7 phôi độ 3 bị thoái hóa độ 3 và 5 phôi độ 3 bị thoái hóa hoàn toàn. Kết quả này của nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của Martin D. và cs., 2006 cho thấy tỷ lệ phôi thoái hoá tăng khi tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương trên 20% và để cải thiện chất lượng phôi nhóm nghiên cứu đã tiến hành lấy các mảnh vỡ bào tương bằng kỹ thuật vi thao tác [66]. Kết quả nghiên cứu của Mandelbaum J. cho thấy tỷ lệ phôi thoái hoá tăng khi tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương cao, tỷ lệ thoái hoá của các phôi có các mảnh vỡ bào tương trên 40% là 33% so với tỷ lệ 20% thoái hoá của các phôi có các mảnh vỡ bào tương dưới 10%. Mandelbaum J. cũng cho rằng các chỉ số khác như tuổi phôi, số lượng tế bào hay độ đồng đều của các phôi bào không có ảnh hưởng có ý nghĩa tới chất
109
lượng phôi sau rã đông [62]. Martin D. và cs. gợi ý rằng phải chăng các mảnh vỡ bào tương làm giảm khả năng sống của phôi cũng như khả năng làm tổ của phôi [66].
- Đối với phôi đông lạnh ngày 5: Tất cả các phôi trước đông lạnh, sau rã đông đều được đánh giá phân loại phôi theo phương pháp đánh giá phôi của David Gardner (2001) [38]. Trong nghiên cứu, phôi trước đông lạnh chủ yếu ở độ 2 và 3 theo độ dãn rộng của phôi, có 2 phôi độ 1, không có phôi nào độ 4, độ 5, độ 6. Về đặc điểm đám tế bào bên trong và đặc điểm tế bào lá nuôi, chúng tôi chỉ chọn những phôi có đánh giá điểm A, B không lựa chọn những phôi có điểm C. Kết quả nghiên cứu cho thấy phôi có điểm đánh giá AA ở các giai đoạn có tỷ lệ sống sau rã đông là 100%, phôi có điểm đánh giá AB có tỷ lệ sống cao hơn phôi có điểm đánh giá BA, phôi có điểm đánh giá BB có tỷ lệ phôi sống thấp nhất là 65,6%. Phôi có độ dãn rộng là độ 2 có tỷ lệ phôi sống là 93,3% cao hơn so với phôi có độ dãn rộng là độ 3 có ý nghĩa thống kê với p = 0,037. Theo chúng tôi có thể phôi ở độ dãn rộng lớn hơn có khoang dịch trong phôi lớn hơn, kích thước phôi to hơn làm ảnh hưởng tới sự ngấm các chất bảo quản lạnh của tế bào làm cho tỷ lệ phôi sống giảm. Nghiên cứu của Hyon-Jin Cho và cộng sự nghiên cứu trên 121 phôi đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa sử dụng lưới đồng trữ lạnh, tác giả đã phân chia phôi ở giai đoạn phôi nang thành 4 giai đoạn: phôi nang giai đoạn sớm có kích thước dưới 140 µm, phôi nang đang dãn rộng giai đoạn sớm có kích thước từ 140 µm đến 160 µm, phôi nang đang dãn rộng trung bình có kích thước 160 µm đến 180 µm và phôi nang đã dãn rộng có kích thước trên 180 µm căn cứ vào sự phát triển của phôi để đánh giá khả năng sống của phôi sau rã đông, kết quả cho thấy: Tỷ lệ sống của phôi sau rã đông ở các giai đoạn tương ứng là 86,5%, 91,7%, 75,8% và 77,8% . Tỷ lệ sống sau rã đông đạt cao nhất ở phôi nang đang dãn rộng giai đoạn sớm . Trong nghiên cứu này tác giả còn đưa ra biện pháp khắc phục để là tăng sự sống của phôi sau rã đông đối với phôi đã dãn rộng hoàn toàn bằng cách thực hiện làm giảm khoang dịch
110
trong phôi, sau khi làm giảm khoang dịch trong phôi thấy tỷ lệ phôi sống của những phôi đã dãn rộng hoàn toàn tăng lên rõ rệt [29].
Pierre Vanderzwalmen (2002) nghiên cứu trên 61 chu kỳ đông lạnh phôi ngày thứ 5 tương ứng với 177 phôi được rã đông , trong đó có 55 phôi ở giai đoạn phôi dâu, 41 phôi ở giai đoạn phôi nang đang dãn rộng và 71 phôi đã dãn rộng hoàn toàn. Sau khi rã đông thấy tỷ lệ phôi sống của phôi dâu là 54,5%, phôi đang dãn rộng là 58,5%, phôi đã dãn rộng hoàn toàn là 20,3%. Tỷ lệ có thai tương ứng là 22,7%; 23,5% và 4,5%. Trong nghiên cứu này tác giả đã cho thấy phôi nang khi đã dãn rộng hoàn toàn có tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ có thai thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với phôi đang dãn rộng, theo tác giả khoang dịch có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sống và làm tổ của phôi [102].
Như vậy, để có được phôi có chất lượng tốt, phôi nguyên vẹn sau rã đông việc lựa chọn phôi thích hợp để trữ lạnh là cần thiết, tránh tốn kém cho bệnh nhân và tiết kiệm thời gian cũng như sức lao động của thầy thuốc. Từ những nghiên cứu trên cho thấy đối với phôi ngày 3 thì tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương được xem như một yếu tố tiên lượng khả năng sống của phôi ngày 3 sau rã đông, phôi nguyên vẹn sau rã đông, tiên lượng khả năng thành công sau chuyển phôi đông lạnh. Đối với phôi ngày thứ 5, có thể căn cứ vào độ dãn rộng của phôi, đặc điểm của tế bào bên trong và tế bào lá nuôi để tiên lượng, có thể chọn những phôi tốt ở giai đoạn sớm phôi nang hay khoang dịch trong phôi còn nhỏ với điểm đánh giá AA, AB, BA. Phôi có điểm đánh giá BB chỉ cho tỷ lệ sống là 65,6%, do vậy nếu chỉ có ít phôi mà điểm đánh giá BB thì có nguy cơ không có phôi để chuyển sau rã đông. Điều này giúp cho việc tư vấn bệnh nhân trước một chu kỳ điều trị.
111