- Vật phẩm được cố định trong dung dịch glutaraldehyt 4% trong dung dịch đệm cacodylat thời gian 5 giờ ở
A. Phôi tươi B Phôi sống nguyên vẹn sau rã đông
4.2.2. Hình thái phôi trước đông lạnh và sau rã đông quan sát dưới kính hiển
vi điện tử
Trong nghiên cứu, chúng tôi chỉ sử dụng một số phôi dư thừa, bệnh nhân không có nhu cầu lưu trữ phôi và những phôi đã lưu trữ nhưng bệnh nhân không có nhu cầu chuyển phôi lưu trữ do đã có đủ con. Số phôi sử dụng cho nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử rất ít, do đó chúng tôi chỉ hy vọng đây là nghiên cứu mô tả một số trường hợp để có thể làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo.
* Hình thái phôi trên kính hiển vi điện tử quét
Quan sát phôi trên kính hiển vi điện tử quét để đánh giá bề mặt của phôi trước đông lạnh và sau rã đông. Những phôi trước đông lạnh (phôi tươi) quan sát thấy bề mặt phôi căng tròn đều, trên bề mặt có thể quan sát thấy tinh trùng, các sợi glycoprotein trên bề mặt của màng trong suốt. Ở độ phóng đại trên 5000 lần thấy trên bề mặt của màng trong suốt còn có những lỗ nhỏ do sự sắp xếp của các glycoprotein dạng sợi tạo thành (ảnh 3.5, 3.19). Đối với phôi sau rã đông (phôi ngày 3, ngày 5) quan sát thấy: những phôi sống thì bề mặt phôi căng tròn đều giống phôi trước đông lạnh. Tuy nhiên, ở độ phóng đại 7500 lần thấy bề mặt của phôi có bị thay đổi, trên bề mặt phôi rất khó quan sát thấy các glycoprotein dạng sợi, có rất ít hoặc không thấy những lỗ như phôi trước đông lạnh (ảnh 3.7, 3.22). Adirekthaworn A. và cộng sự (2008) đã nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc của bề mặt màng trong suốt của noãn lợn trước đông lạnh và sau rã đông qua kính hiển vi điện tử quét. Kết quả thấy ở bề mặt màng trong suốt của noãn tươi thấy có các lỗ và các hốc do các glycoprotein dạng sợi tạo thành, trái lại, ở noãn sau rã đông thấy trên bề mặt màng trong suốt khó quan sát thấy rất ít các lỗ (Hình 4.1). Tác giả cho rằng sự thay đổi màng trong suốt cũng có thể là nguyên nhân khiến cho noãn sau rã đông có tỷ lệ thụ tinh kém hơn [19]. Moreira da Silva F. (2005) nghiên cứu trên phôi lợn cũng cho kết quả tương tự (trích dẫn từ [19]).
112
Hình 4.1. Bề mặt của noãn (SEM) A. Noãn tươi ; B. Noãn sau rã đông
* Nguồn theo Adirekthaworn A.(2008) [19].
* Hình thái phôi dưới kính hiển vi điện tử truyền qua
- Sự thay đổi màng trong suốt trước đông lạnh và sau rã đông:
Từ khi có kỹ thuật đông lạnh phôi ra đời, các nhà khoa học luôn nghiên cứu để tìm ra những giải pháp khắc phục những yếu tố ảnh hưởng do quá trình đông lạnh giúp cho phôi có khả năng làm tổ tốt nhất. Rất nhiều nghiên cứu đã khẳng định chuyển phôi đông lạnh có tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm tổ thấp hơn so với chuyển phôi tươi. Màng trong suốt là màng có cấu trúc là glycoprotein, có chức năng chống đa thụ tinh trong quá trình thụ tinh và sau khi đã tạo phôi màng trong suốt có chức năng bảo vệ phôi. Chính vì vậy, khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông lạnh phôi người ta cũng phải xét đến cấu trúc của màng trong suốt. Sử dụng
A
113
kính hiển vi đảo ngược và kính hiển vi có ánh sáng phân cực chỉ đo được độ dầy màng trong suốt, không đánh giá được sự thay đổi cấu trúc bên trong màng trong suốt. Trong nghiên cứu của chúng tôi cũng chỉ ra độ dầy màng trong suốt của phôi trước đông lạnh và sau rã đông là không khác biệt.
Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua, với độ phóng đại 10.000 lần, chúng tôi quan sát thấy màng trong suốt của phôi tươi có rất nhiều các sợi glycoprotein sắp xếp theo các chiều hướng khác nhau ở cả phôi ngày 3 và phôi ngày 5 trước khi đông lạnh (ảnh 3.10, 3.25). Tuy nhiên, đối với phôi sau rã đông, quan sát ở cùng độ phóng đại chúng tôi thấy cấu trúc màng trong suốt mịn hơn, giảm mật độ điện tử, do đó khó quan sát thấy rõ các sợi glycoprotein như phôi trước đông lạnh (ảnh 3.13, 3.30). Điều này có thể gợi ý cho thấy rằng cấu trúc của màng trong suốt có thể bị ảnh hưởng trong quá trình đông lạnh và rã đông đã làm đông vón các protein làm cho màng trong suốt bị mất độ xốp.
Nottola S.A. và cộng sự (2008) đã nghiên cứu sự thay đổi hình thái siêu cấu trúc của 12 noãn tươi 12 noãn sau rã đông bằng phương pháp đông lạnh chậm trên kính hiển vi điện tử truyền qua. Kết quả cho thấy ở nhóm noãn tươi thấy bào tương tế bào đồng nhất, các bào quan có cấu trúc nguyên vẹn, màng trong suốt liên tục. Ở nhóm noãn sau rã đông bằng phương pháp đông lạnh chậm thấy xuất hiện các không bào trong bào tương tế bào và cấu trúc của màng ti thể, lưới nội bào bị thay đổi, màng trong suốt thấy giảm mật độ điện tử, điều này có thể làm cho màng trong suốt bị “cứng” sau rã đông làm ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh của noãn sau rã đông [74].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, phôi sau rã đông có hỗ trợ thoát màng cho tỷ lệ phôi làm tổ và tỷ lệ có thai cao hơn so với nhóm không hỗ trợ thoát màng: Valojerdi MR và cs (2008) nghiên cứu trên 410 bệnh nhân lớn tuổi (trên 37 tuổi), 796 bệnh nhân có thất bại làm tổ nhiều lần và 180 bệnh nhân có phôi rã
114
đông, mỗi nhóm bệnh nhân lại được chia thành 2 nhóm: Nhóm có hỗ trợ thoát màng và nhóm không hỗ trợ thoát màng. Kết quả cho thấy đối với nhóm bệnh nhân lớn tuổi, bệnh nhân thất bại làm tổ nhiều lần thì tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm tổ của phôi có hỗ trợ thoát màng và phôi không hỗ trợ thoát màng là như nhau. Tuy nhiên, đối với phôi đông lạnh nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ có thai; tỷ lệ làm tổ của nhóm có hỗ trợ thoát màng và nhóm không có hỗ trợ thoát màng tương ứng là 31,2% ; 12,8% và 11,1%; 4,2%. Sự khác nhau này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 [100]. Tại Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu Công nghệ phôi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 257 phôi sau rã đông của 98 bệnh nhân, Số bệnh nhân được chia thành 2 nhóm: nhóm 1 gồm 54 bệnh nhân có phôi sau rã đông được thực hiện hỗ trợ thoát màng và nhóm 2 gồm 44 bệnh nhân có phôi sau rã đông không được thực hiện thoát màng, bệnh nhân của hai nhóm có độ tuổi trung bình, số năm vô sinh trung bình, độ dầy niêm mạc tử cung trung bình, số phôi chuyển trung bình là như nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm tổ tương ứng của nhóm 1 là 33,33% và 16,26% trong khi nhóm 2 có tỷ lệ tương ứng là 15,90% và 7,14%. Sự khác biệt giữa 2 nhóm có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Nghiên cứu của Balaban và cs. (2006) cho thấy tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm tổ của phôi có hỗ trợ thoát màng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm không thực hiện hỗ trợ thoát màng [22].
Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên kính hiển quang học cho thấy độ dầy màng trong suốt của phôi không bị thay đổi sau rã đông. Tuy nhiên, nghiên cứu trên hiển vi điện tử quét và hiển vi điện tử truyền qua cho thấy cấu trúc màng trong suốt bị thay đổi cả bề mặt và cấu trúc bên trong màng. Chúng tôi cho rằng, cấu trúc của màng trong suốt là màng glycoprotein, quá trình làm lạnh và rã đông có thể gây đông vón các protein, màng trong suốt lại là nơi tiếp xúc đầu tiên với chất bảo quản, cũng như nơi trực tiếp tiếp xúc với nhiệt độ bị thay đổi. Đây có thể là tiền đề gợi ý giải thích lý do màng trong suốt bị “cứng” sau rã đông.
115
- Sự thay đổi cấu trúc của các thành phần trong bào tương các tế bào của phôi: Quan sát các phôi bào (phôi ngày 3 - ảnh 3.14), các tế bào lá nuôi và tế bào ICM (phôi ngày 5 - ảnh 3.31, 3.32) trong các phôi sống sau rã đông chúng tôi thấy màng tế bào còn nguyên vẹn, các thành phần hữu hình trong bào tương như: Ti thể, lưới nội bào, bộ Golgi, các hạt glycogen; màng nhân, chất nhân, hạt nhân, chất nhiễm sắc không thấy khác so với phôi trước đông lạnh. Tuy nhiên, trong bào tương tế bào chúng tôi thấy có xuất hiện một số không bào. Đối với những phôi bị thoái hóa sau rã đông chúng tôi thấy màng tế bào nhăn nheo, liên kết giữa các tế bào lỏng lẻo, màng nhân có thể bị đứt đoạn, các ti thể lưới nội bào bị trương phồng lên. Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả tương tự như của Bettencourt E.M.V. (2008) tiến hành nghiên cứu đặc điểm siêu cấu trúc của phôi cừu tươi và sau rã đông bằng phương pháp đông lạnh chậm trên kính hiển vi điện tử truyền qua. Kết quả nghiên cứu cho thấy phôi có chất lượng tốt sau khi rã đông ít bị tổn thương, phôi có chất lượng kém khi đông lạnh phôi sẽ bị tổn thương nhiều, các tổn thương chủ yếu thấy ở ti thể bị tổn thương, màng nhân có thể bị đứt đoạn, các tế bào không có mối liên kết chặt chẽ, trong bào tương có thể thấy xuất hiện các khoảng trống, mật độ điện tử giảm, đặc biệt thấy xuất hiện nhiều các không bào [25]. Nghiên cứu này cũng tương tự như một số tác giả nghiên cứu trên phôi bò đông lạnh bằng kỹ thuật đông lạnh chậm [17], [30], [75].
Như vậy, có thể nói quá trình đông lạnh có làm tổn thương tế bào nhưng ở một ngưỡng nhất định, đối với những tế bào còn sống sau rã đông ở những phôi có chất lượng tốt thì sau rã đông sẽ ít bị ảnh hưởng đến cấu trúc: đặc biệt là các thành phần quan trọng như ti thể, lưới nội bào, nhân, chất nhiễm sắc trong nhân. Điều này có thể chứng minh được bằng các trẻ sinh ra từ phôi đông lạnh hoàn toàn khỏe mạnh như những trẻ được sinh ra từ phôi tươi [50], [105]. Những phôi có chất lượng không tốt không chịu được các thay đổi xảy ra trong tế bào thì sẽ bị tổn thương tới các thành phần như màng tế bào, ti thể, lưới nội bào và nhân tế bào làm cho phôi bị thoái hóa sau rã đông. Các phôi thoái hóa sẽ không được sử dụng để chuyển phôi.
116