- Vật phẩm được cố định trong dung dịch glutaraldehyt 4% trong dung dịch đệm cacodylat thời gian 5 giờ ở
2.2.4. Đánh giá hình thái cấu trúc phôi.
2.2.4.1. Hình thái phôi trước đông * Đánh giá hình thái phôi ngày 3
Quan sát hình thái cấu trúc phôi bằng kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70, độ phóng đại 200 lần:
Theo cách phân loại hình thái phôi của Andres Salumets (2001) [83] dựa theo số phôi bào, bào tương phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương trong phôi: Có 4 loại:
Hình 2.6. Phân độ phôi theo Andres Salumets (2001)
IV – Phôi độ IV; III - Phôi độ III; II – Phôi độ II; I – Phôi độ I - Phôi độ IV: phôi có 6 - 8 tế bào đồng đều không có mảnh vỡ bào tương.
IV III
48
- Phôi độ III: phôi có 6 - 8 tế bào đồng đều, mảnh vỡ bào tương chiếm dưới 20% thể tích phôi.
- Phôi độ II: phôi có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương chiếm từ 20 - 50% thể tích phôi.
- Phôi độ I: phôi có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương chiếm trên 50% thể tích phôi
* Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phôi nang
Phôi nang được đánh giá theo hệ thống đánh giá điểm của tác giả D.K. Gardner (2001) [38]:
Hệ thống phân độ phôi dựa theo 3 đặc điểm phát triển của phôi nang: - Độ dãn rộng và tình trạng thoát màng của phôi.
- Đặc điểm tính chất của khối tế bào trong phôi (inner cell mass – ICM). - Đặc điểm tính chất của lớp lá nuôi tế bào (Trophoectoderm – TED).
Bảng 2.1. Đặc điểm độ dãn rộng của phôi Độ dãn
rộng của
phôi Giai đoạn phôi Tiêu chuẩn
1 Giai đoạn sớm phôi nang Khoang phôi < 50% thể tích của phôi. 2 Phôi nang Khoang phôi ≥ 50% thể tích của phôi. 3 Phôi nang đầy đủ Khoang phôi chiếm hoàn toàn phôi 4 Phôi nang mở rộng Khoang phôi có thể tích lớn hơn phôi
nang giai đoạn sớm và màng zona mỏng đi.
5 Phôi nang đang thoát màng
Lá nuôi tế bào bắt đầu thoát khỏi màng trong suốt.
6 Phôi nang đã thoát màng Phôi nang hoàn toàn thoát khỏi màng trong suốt.
* Nguồn: theo Gardner D. K. (2001) [38].
Các phôi nang được phân loại dựa trên sự đánh giá phát triển của khối tế bào bên trong (ICM - inner cell mass) và lá nuôi tế bào được cho điểm theo 3 mức độ A, B, C như sau:
49
Bảng 2.2. Đặc điểm đám tế bào bên trong của phôi (ICM)
Loại ICM Đặc điểm của khối tế bào trong phôi (ICM)
A Có nhiều tế bào, gắn kết chặt với nhau B Có vài tế bào, gắn kết lỏng lẻo
C Có rất ít tế bào
* Nguồn: theo Gardner D. K. (2001) [38].
Bảng 2.3. Đặc điểm lớp lá nuôi tế bào (TED)
Loại TED Đặc điểm của lá nuôi tế bào (TED)
A Có nhiều tế bào tạo nên biểu mô liên kết chặt chẽ với nhau B Có ít tế bào
C Rất ít tế bào tạo nên một biểu mô lỏng lẻo
50
1. Giai đoạn sớm phôi nang 2. Giai đoạn sớm phôi nang 3. Phôi nang 1AB
4. Phôi nang 2AB 5. Phôi nang 2BC 6. Phôi nang 3BB
7. Phôi nang 4AA 8. Phôi nang 4AB 9. Phôi nang 4BB
10. Phôi nang đang thoát màng
Hình 2.7 : Giai đoạn phát triển và phân loại phôi nang
51
2.2.4.2. Hình thái phôi sau rã đông
* Về hình thái phôi: Dựa vào sự phân độ ở trên, phôi sau rã đông còn nguyên vẹn được đánh giá phân độ phôi theo 2 giai đoạn như trên.
Các phôi thoái hoá được đánh giá dựa vào phần trăm thoái hoá theo tiêu chuẩn hình thái học của Brian Dale và Kay Elder (1997) [27]:
+ Thoái hóa độ 1: Thoái hoá dưới 25% + Thoái hóa độ 2: Thoái hoá 25% - 50% + Thoái hóa độ 3: Thoái hoá trên 50% + Thoái hóa độ 4: Thoái hoá hoàn toàn
* Về độ dầy màng trong suốt, đường kính phôi: Tất cả phôi sau rã đông đều được tiến hành đo độ dầy màng trong suốt và kích thước phôi bằng phần mềm Axio version 4.8 của hãng Carl Zeiss và so sánh với trước khi đông lạnh.
2.2.4.3. Đánh giá hiệu quả trữ phôi
Hiệu quả của việc trữ phôi được đánh giá qua:
+ Khả năng sống của phôi sau khi rã đông: phôi được đánh giá về hình dạng 1 giờ sau khi rã đông. Chỉ số sống (survival index) tính bằng tỷ lệ tế bào còn sống trên tổng số tế bào. Phôi được xem là còn sống khi có từ 50% số tế bào còn sống trở lên.
+ Khả năng phát triển của phôi trong môi trường nuôi cấy: đánh giá phôi sau 24 giờ (nuôi cấy phôi qua đêm), biểu hiện bằng tỷ lệ sống (survival rate) tính bằng tỷ lệ phôi sống trên tổng số phôi được rã đông.
+ Tỷ lệ phôi làm tổ sau khi chuyển.
2.2.4.4. Đánh giá hình thái phôi trước chuyển phôi * Phôi ngày 3 sau rã đông
Dựa vào các phân độ phôi trước đông, độ thoái hoá và sự phân chia tiếp của phôi sau khi nuôi cấy qua đêm. Phôi trước khi chuyển được chia làm 4 độ.
+ Phôi độ 1: Phôi có mảnh vỡ bào tương > 50%, hoặc thoái hoá sau rã đông trên 50%.
52
+ Phôi độ 2: là phôi khi nuôi cấy qua đêm không có phôi bào nào phân chia tiếp, hoặc phôi có tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương 25 – 50%, các phôi bào không đồng đều.
+ Phôi độ 3: là những phôi sau rã đông có thoái hoá < 50%, sau khi nuôi cấy qua đêm có ít nhất 1 phôi bào phân chia hoặc các phôi bào có tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương từ 10 – 25 %, các phôi bào tương đối không đồng đều.
+ Phôi độ 4: là những phôi sau rã đông còn nguyên vẹn không bị thoái hoá, khi nuôi qua đêm có ít nhất 1 phôi bào phân chia tiếp và tỷ lệ mảnh vỡ bào tương < 10%.
* Phôi ngày 5 (phôi nang) sau rã đông: Số phôi có đám tế bào bên trong và lớp tế bào lá nuôi còn nguyên vẹn, hoặc phôi tiếp tục dãn rộng sau rã đông thì được sử dụng để chuyển phôi và được phân độ như phôi trước đông lạnh.
2.2.4.5. Các chỉ tiêu mô tả hình thái cấu trúc phôi trên kính hiển vi điện tử quét, và hiển vi điện tử truyền qua
- Mô tả sự biến đổi bề mặt màng trong suốt của phôi trước đông lạnh và sau rã đông (trên kính hiển vi điện tử quét)
- Mô tả sự biến đổi cấu trúc màng trong suốt của phôi trước đông lạnh và sau rã đông
- Mô tả sự biến đổi cấu trúc của màng tế bào, các bào quan trong bào tương, nhân tế bào của các phôi bào trước đông lạnh và sau rã đông