- Vật phẩm được cố định trong dung dịch glutaraldehyt 4% trong dung dịch đệm cacodylat thời gian 5 giờ ở
4.1.Về đối tượng nghiên cứu và phương pháp thu thập số liệu
A. Phôi tươi B Phôi sống nguyên vẹn sau rã đông
4.1.Về đối tượng nghiên cứu và phương pháp thu thập số liệu
* Đối tượng nghiên cứu
Để đáp ứng các mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi chọn tất cả các phôi đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa đã được rã đông của các bệnh nhân đến khám và điều trị tại Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu Công nghệ phôi, Học viện Quân y từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 6 năm 2012.
- Tổng số bệnh nhân có phôi đông lạnh là 157 (tương ứng với 167 chu
kỳ) có phôi đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa đã được rã đông. Các bệnh nhân này được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm:
+ Nhóm I: 79 bệnh nhân (tương ứng với 86 chu kỳ) có phôi đông lạnh nuôi cấy ở ngày thứ 3 đã được rã đông. Trong đó có 6 chu kỳ rã đông lần 2 và 1 chu kỳ rã đông lần 3.
+ Nhóm II: 78 bệnh nhân (tương ứng với 81 chu kỳ) có phôi đông lạnh nuôi cấy ở ngày thứ 5 đã được rã đông. Trong đó có 3 chu kỳ rã đông lần 2, không có chu kỳ nào rã đông lần 3.
Các bệnh nhân có tuổi trung bình là 31,7 ± 3,6, trong đó nhóm I có tuổi trung bình là 31,5 ± 3,4 và nhóm II có tuổi trung bình là 32,0 ± 3,6. Sự khác nhau về tuổi giữa 2 nhóm là không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
Số năm vô sinh trung bình của nhóm I là 6,4 ± 3,6, của nhóm II là 6,7 ± 4,3. Sự khác nhau về số năm vô sinh trung bình ở 2 nhóm không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản được điều trị cho các bệnh nhân ở 2 nhóm là tương đối đồng đều như nhau (bảng 3.4).
Lý do đông lạnh phôi ở cả 2 nhóm chủ yếu là do bệnh nhân có phôi dư thừa sau chuyển phôi tươi (bảng 3.5).
102
Phân loại vô sinh nguyên phát và thứ phát, nguyên nhân vô sinh ở 2 nhóm cũng phân bố tương đối đồng đều (bảng 3.6).
Như vậy, do việc phân chia ngẫu nhiên cho 2 nhóm nên chúng tôi thấy các đặc điểm của bệnh nhân tương đối giống nhau về tuổi, số năm vô sinh, chẩn đoán vô sinh, lý do lưu phôi,… Điều này đảm bảo cho việc so sánh phân tích số liệu giữa 2 nhóm về tỷ lệ có thai, tỷ lệ làm tổ của phôi và phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả có thai của bệnh nhân sẽ không bị gây nhiễu bởi các yếu tố này. Đây là một nghiên cứu mô tả có phân tích, cỡ mẫu được tính theo đối tượng là phôi, số phôi này là của các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu, với số lượng bệnh nhân là 157 tương ứng với 167 chu kỳ chúng tôi cho rằng kết quả nghiên cứu đảm bảo độ tin cậy.
- Tổng số phôi của 157 bệnh nhân trên là 444 phôi, với số phôi này, chúng tôi phân tích sự thay đổi hình thái cấu trúc phôi trước đông lạnh và sau rã đông, tất cả các phôi này đều được chụp ảnh đo độ dầy màng trong suốt, đếm số lượng phôi bào trước đông lạnh và sau khi rã đông (đối với phôi ngày 3 – nhóm I), đếm số lượng tế bào lá nuôi trên một mặt phẳng (đối với phôi ngày 5 - nhóm II). Trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu này, cỡ mẫu tối thiểu chúng tôi tính được cho mỗi nhóm là 184, nhóm I có 250 phôi, nhóm II có 194 phôi, cả 2 nhóm đều vượt qua cỡ mẫu tối thiểu. Như vậy, với cỡ mẫu trên chúng tôi cho rằng cỡ mẫu đủ lớn để phân tích các đặc điểm cấu trúc hình thái phôi đảm bảo kết quả nghiên cứu là đáng tin cậy.
* Phương pháp thu thập số liệu:
Các số liệu về hình ảnh phôi nuôi cấy ngày thứ 3 được thu thập bằng cách chụp ảnh qua kính hiển vi đảo ngược Olympus IX-70, các phôi của bệnh nhân đặt trong môi trường nuôi cấy, giữ ấm bằng đĩa nhiệt ở nhiệt độ 37o
C, thời gian chụp ảnh trong vòng 1 phút. Do đó đảm bảo tính chính xác của hình ảnh phôi mà không ảnh hưởng đến chất lượng và tỉ lệ sống của phôi.
103
Ảnh chụp thước đo chuẩn với khoảng cách đơn vị đo tối thiểu là 10µm cũng được chụp trên cùng kính hiển vi đảo ngược Olympus IX-70, với cùng vật kính để đảm bảo độ chính xác khi phân tích các chỉ tiêu đo đạc.
* Phương pháp đo đạc và xử lý số liệu:
Các chỉ tiêu đo đạc về kích thước của phôi như đường kính của phôi, độ dầy màng trong suốt được đo sử dụng phần mềm chuyên dụng cho phân tích hình thái phôi thai học, Axio Vision 4.8 for Carl Zeiss Imaging Solution (hãng Carl Zeiss). Các số liệu đo đạc được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình, phép đo sử dụng phần mềm Axio Vision 4.8 đảm bảo tính chính xác với khả năng đo 3 chữ số sau dấu phẩy.
* Phương pháp và các kỹ thuật nghiên cứu
Việc đánh giá chất lượng phôi trước khi đông lạnh đóng vai trò rất quan trọng để tiên lượng phôi giữ lại chuyển phôi tươi và khả năng sống của phôi dư sau đông lạnh. Tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản có cách đánh giá phôi khác nhau, nhưng nhìn chung các trung tâm đều chọn những phôi có chất lượng tốt nhất để chuyển phôi tươi, còn lại những phôi có chất lượng tốt mới đem trữ lạnh vì theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì những phôi có chất lượng kém (tỷ lệ mảnh vỡ bào tương trên 20%, phôi nang có điểm đánh giá về đặc điểm tế bào lá nuôi và tế bào ICM là điểm C) thì khả năng sống của phôi sau rã đông là rất thấp [9], [12], [15], [85].
Tại Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Công nghệ phôi chúng tôi chọn cách phân độ phôi theo tác giả Andres Salumets, 2001 [83] đối với phôi ngày thứ 3 vì chúng tôi thấy tiện lợi cho cách đánh giá phôi và dễ sử dụng. Nhìn chung, nhiều nghiên cứu trên thế giới [24], [85], [93] cũng dùng cách phân độ phôi của tác giả Andres Salumets, 2001. Tuy nhiên một số nghiên cứu thì dùng cách phân độ phôi của Brian Dale và Kay Elder (1997) [27] như trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh [9], Lê Thị Phương Lan [4], Gvakharia M. và cs. [44]. Cách phân độ phôi theo Andres Salumets, 2001
104
đã được trình bày trong chương 2, phân độ phôi theo Brian Dale và Kay Elder như sau: dựa vào tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương, tốc độ phân chia của các phôi bào và độ đồng đều giữa các phôi bào:
- Phôi độ 1: Độ chiết quang sáng, màng zona còn nguyên vẹn, các tế bào đồng đều, không có mảnh vỡ bào tương hoặc mảnh vỡ bào tương dưới 10%, phôi ngày 2 có 4 - 5 tế bào, phôi ngày 3 từ 6 - 8 tế bào.
- Phôi độ 2: Phôi ngày 2 có 3 - 4 tế bào hoặc ngày 3 có 6 - 8 tế bào, các tế bào tương đối đồng đều, hoặc tỷ lệ mảnh vỡ bào tương 10 - 25%.
- Phôi độ 3: Phôi ngày 2 có 2 tế bào hoặc phôi ngày 3 có 3-4 tế bào; những phôi có độ mảnh vỡ bào tương từ 25% đến 50%, hoặc các tế bào không đồng đều nhau, màng trong suốt còn nguyên vẹn.
- Phôi độ 4: những phôi có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương trên 50%.
Trong nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng cách phân độ phôi của Andres Salumets và cs. (2001) [83]. Theo chúng tôi, cách phân độ phôi này đơn giản phù hợp với thời gian ngắn 2 - 3 phút khi quan sát phôi ở ngoài tủ nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy cách đánh giá hình thái phôi này hoàn toàn có thể tiên lượng được khả năng sống của phôi trước khi đông lạnh và khả năng phát triển của phôi sau rã đông để chuyển cho bệnh nhân.
Đối với phôi đông lạnh ở ngày thứ 5, chúng tôi lựa chọn phương pháp đánh giá phôi của David Gardner (2001) [38]. Đây là phương pháp đánh giá phôi nang được hầu hết các trung tâm IVF sử dụng vì phương pháp này dễ sử dụng, đánh giá chi tiết 3 tiêu chuẩn về độ dãn rộng của phôi, đặc điểm của đám tế bào bên trong (ICM), đặc điểm của đám tế bào lá nuôi. Đối với phương pháp này chúng tôi dùng để đánh giá phôi trước đông lạnh, sau rã đông và sau nuôi cấy. Một số tác giả dùng phương pháp đánh giá phôi khác như: phương pháp đánh giá phôi của Denny Sakkas (2009) [82],
105
đánh giá phôi của Denny Sakkas dựa trên 3 tiêu chí giống như của David Gardner, nhưng phương pháp này chỉ đánh giá độ dãn rộng của phôi ở 4 giai đoạn, không có giai đoạn phôi bắt đầu thoát màng và phôi thoát màng, như vậy sẽ không đánh giá hết được phôi nuôi cấy sau rã đông. Đối với phương pháp đánh giá phôi của Weon-Young Son (2009), tác giả chia phôi nang thành 4 giai đoạn dựa vào độ dãn rộng của phôi, đường kính phôi:
1. Phôi nang giai đoạn sớm (ErB – Early Blastocyts): Khoang phôi chiếm dưới 50% thể tích phôi (đường kính trung bình <140µm).
2. Phôi nang đang dãn rộng (EEB – Early Expanding Blastocyst), khoang
phôi chiếm trên 50% thể tích phôi (đường kính phôi trung bình từ 140 – 160µm).
3. Phôi nang dãn rộng trung bình (MEB – Middle expanded blastocyst: khoang phôi chiếm toàn bộ thể tích phôi, phôi vẫn đang tiếp tục dãn rộng (đường kính phôi từ 160 -180µm).
4. Phôi nang đã dãn rộng hoàn toàn (EdB – Expanded blastocyst) (đường kính phôi >180µm).
Tiêu chuẩn về đám tế bào bên trong (ICM) và tế bào lá nuôi được chia thành 4 loại:
- Loại A: Nhìn rõ đám tế bào bên trong và lớp lá nuôi tế bào - Loại B: Đám tế bào bên trong rõ nhưng lớp lá nuôi tế bào kém
- Loại C: Đám tế bào bên trong kém nhưng lớp lá nuôi tế bào phát triển tốt - Loại D: Cả đám tế bào bên trong và lớp lá nuôi tế bào đều ít, rời rạc.
Phương pháp này đã đánh giá phôi nang sau rã đông và cho thấy phôi ở giai đoạn đang dãn rộng và dãn rộng trung bình là cho tỷ lệ sống cao nhất. Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này cũng không đánh giá được phôi nuôi cấy thêm 1 ngày sau rã đông vì có những phôi phát triển rất nhanh, sau rã đông nuôi cấy thêm 1 ngày phôi có thể đang thoát màng hoặc thoát màng.
106
Như vậy, chúng tôi lựa chọn phương pháp của David Gardner là phương pháp phổ biến rộng rãi, được nhiều trung tâm áp dụng và có thể đánh giá được phôi nuôi cấy sau rã đông. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy cách đánh giá phôi này hoàn toàn có khả năng tiên lượng đánh giá lựa chọn phôi trước khi đông lạnh để sau khi rã đông phôi đạt tỷ lệ sống và tỷ lệ có thai cao nhất.