- Vật phẩm được cố định trong dung dịch glutaraldehyt 4% trong dung dịch đệm cacodylat thời gian 5 giờ ở
A. Phôi tươi B Phôi sống nguyên vẹn sau rã đông
4.3. Hình thái phôi sau rã đông và sau nuôi cấy
Một số trung tâm thụ tinh ống nghiệm thường tiến hành chuyển phôi sau rã đông 3 giờ. Nhiều tác giả thấy rằng khoảng thời gian này không đủ để đánh khả năng phát triển tiếp của phôi trữ lạnh sau rã đông. Để đánh giá khả năng tiếp tục phát triển của phôi sau rã đông, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy phôi qua đêm sau rã đông trong môi trường nuôi cấy.
- Đối với phôi đông lạnh ngày 3: Kết quả nhận thấy khi nuôi qua đêm hình thái phôi có thay đổi, phần lớn các phôi độ 3, độ 4 sau rã đông tiếp tục phân chia, trong quá trình tiếp tục phân chia có thấy số phôi độ 4 sau rã đông là 113 phôi, tăng lên so với phôi trước đông 24 phôi do một số phôi độ 3 sau khi nuôi cấy có ít nhất 1 tế bào phân chia sẽ được đánh giá là phôi độ 4. Số phôi độ 3 giảm đi do một số phát triển thành phôi độ 4, một số phôi độ 3 không phân chia nữa trở thành phôi độ 2, một số phôi thoái hóa dưới 50% sau khi nuôi cấy tiếp tục phân chia tạo thành phôi độ 3. Số phôi độ 2 là do những phôi độ 3, độ 4 không tiếp tục phát triển sau nuôi cấy tạo thành. Kết quả sau khi nuôi cấy phôi rã đông 24 giờ, chúng tôi thấy tỷ lệ phôi tiếp tục phát triển là 68,4%. Tỷ lệ phôi độ 4 phân chia tiếp là 83,8%, tỷ lệ phân chia tiếp của phôi độ 3 là 57,4%. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Balaban B. và cs. [23] khi nghiên cứu trên 234 phôi ngày 3 rã đông có 222 phôi sống và 134 phôi tiếp tục phát triển thành phôi nang. Nghiên cứu của H. Tomari và cs. trên 1094 phôi ngày 2 rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa cho kết quả 1053 phôi sống (tỷ lệ phôi sống là 96,3%) và 727 phôi tiếp tục phân chia (tỷ lệ phôi tiếp tục phân chia là 69%) [93].
- Đối với phôi ngày 5: Phôi sau rã đông phải nuôi cấy trong môi trường G2 từ 3 - 4 giờ phôi mới dãn rộng trở lại như trước đông lạnh, những phôi được đánh giá là sống khi phôi dãn rộng trở lại, những phôi không dãn rộng trở lại được thì đánh giá là phôi thoái hóa. Tuy nhiên trong số phôi sống sau rã đông vẫn có những phôi chỉ dừng lại ở đó mà không tiếp tục phát triển. Để đánh giá được khả năng phôi tiếp tục phát triển hay không chúng tôi tiếp tục nuôi cấy phôi qua đêm. Trong nghiên cứu, độ dầy màng trong suốt và đường kính phôi
117
trung bình của phôi trước đông và sau rã đông khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, sau khi nuôi cấy qua đêm chúng tôi thấy độ dầy màng trong suốt trung bình là 10,9 ± 1,75µm mỏng hơn so với độ dầy màng trong suốt sau rã
đông đo được là 12,4 ± 1,3 µm, sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p = 0,001. Đường kính trung bình của phôi sau rã đông đo được là 152,7 ±
9,8µm, sau khi nuôi cấy là 161,7 ± 19,5µm, như vậy, đường kính phôi sau nuôi cấy tăng lên có ý nghĩa thống kê so với phôi sau rã đông với p = 0,001. Số tế bào lá nuôi đếm được trên một mặt phẳng của phôi sau rã đông giảm đi rõ rệt so với phôi trước đông lạnh. Tuy nhiên, sau nuôi cấy số tế bào lá nuôi tăng lên rõ rệt so với phôi sau rã đông với p = 0,001. Phôi tiếp tục phát triển được thể hiện là kích thước phôi to lên, màng trong suốt mỏng đi, số tế bào lá nuôi trên một mặt phẳng quan sát tăng lên. Tỷ lệ phôi phát triển sau nuôi cấy là 75,1%, trong đó những phôi có chất lượng phôi trước đông tốt, sau rã đông có tỷ lệ phôi sống cao và tỷ lệ phôi tiếp tục phát triển cũng cao hơn, thể hiện trên biểu đồ 4.1.
Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ phôi ngày thứ 5 tiếp tục phát triển theo phân độ chất lượng phôi
Bharat V. Joshi và cs nghiên cứu trên 2 nhóm bệnh nhân, nhóm A gồm 415 chu kỳ thực hiện phôi sau rã đông nuôi cấy qua đêm và nhóm B gồm 89 chu
96,3 100 74 79,2 40 66,7 9 40 0 20 40 60 80 100 120 Độ 2 Độ 3 AA AB BA BB
118
kỳ không thực hiện nuôi cấy phôi sau rã đông qua đêm. Kết quả: nhóm A có tỷ lệ có thai 24,3% và tỷ lệ có thai của nhóm B là 20,3% [47]. Nghiên cứu của Fabrice Guerif và cs. cũng cho thấy nhóm nuôi cấy phôi sau rã đông qua đêm cho tỷ lệ có thai cao hơn so với nhóm chỉ nuôi cấy 4 giờ sau rã đông [43]. Như vậy, có thể coi việc nuôi cấy phôi qua đêm như một phương tiện tự lựa chọn của phôi, chỉ có những phôi tốt sẽ có khả năng phát triển và có khả năng làm tổ, do đó giúp cho chúng tôi tiên lượng được khả năng phát triển của phôi từ đó dự đoán khả năng làm tổ của phôi để có thể quyết định số lượng phôi rã đông cho một chu kỳ rã đông (đối với bệnh nhân có nhiều phôi đông lạnh), số lượng phôi chuyển cho một chu kỳ, làm giảm tỷ lệ đa thai cũng như tiết kiệm phôi cho một chu kỳ rã đông đối với những bệnh nhân có nhiều phôi đông lạnh.