- Nước (Rinsing Water RW)
3.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella: theo ISO 6579 Ờ
*Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
Các mẫu lấy về ựược (25ml nước, 25g thức ăn, 25g chất chứa manh tràng, gạc lau các loại Ầ) cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho thêm dung dịch ựệm Buffered Pepton Water theo tỷ lệ 1/10. đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu trong 1 phút với tốc ựộ 230 vòng/ phút. để tủ ấm 37ỨC trong vòng 16 Ờ 18 giờ.
* Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lấy dung dịch ở trên nuôi cấy trên 2 môi trường:
- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc cho vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Mueller Kauffmann, dùng máy (voltex) lắc ựều, ựể vào tủ ấm 37ỨC/18 - 24h.
đọc kết quả: môi trường Mueller Kauffmann có thể biến ựổi màu sắc.
- Nuôi cấy trên môi trường RV ở 41,50C trong 24-48 giờ. Từ môi trường Mueller Kauffmann chuyển sang nuôi cấy trên môi trường XLT4 ở 370C/24 giờ. Từ môi trường RV chuyển sang nuôi cấy trên môi trường Rambach ở 370C/24 giờ.
* Bước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọc
Dùng que cấy lấy một vòng canh trùng từ ống tăng sinh Mueller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc ựều hỗn dịch trong ống), ria cấy sang môi trường ựĩa thạch XLT4. để tủ ấm 37ỨC/18 - 24h.
đọc kết quả: Trên môi trường XLT4 sau 24 h ựể tủ ấm 370 C khuẩn lạc có kắch thước trung bình, màu ựen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
Từ môi trường RV chuyển sang nuôi cấy trên môi trường Rambach ở 370C/24 giờ.
Trên môi trường Rambach sau 24h ựể tủ ấm 370C khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn lồi trên mặt thạch.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
* Bước 4: Kiểm tra các ựặc tắnh sinh hoá
Từ môi trường XLT4 chọn một khuẩn lạc ựiển hình nuôi cấy trong môi trường Kligler: ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng sau ựó cấy chắch sâu ở phần thạch ựứng xuống tận ựáy ống nghiệm, ựể tủ ấm 37ỨC/18 - 24h, ựọc kết quả:
+ Nếu phần thạch nghiêng có màu hồng: Lactose âm tắnh + Nếu phần thạch ựứng có màu vàng: Glucose dương tắnh + Nếu có bọt khắ: sinh hơi dương tắnh
+ Nếu dọc ựường cấy chắch sâu có màu ựen: H2S dương tắnh.
Những mẫu có phản ứng ựặc trưng của vi khuẩn Salmonella trên môi trường Kligler (lên men ựường Glucose, không lên men ựường Lactose, sinh hơi, H2S dương tắnh) ựược cấy kiểm tra vào môi trường: Ure, Lysine, Cimmon citrate, kiểm tra ựặc tắnh sinh hoá, ựể tủ ấm 37ỨC/18 - 24h, ựọc kết quả:
+ Cimmon citrate: phần thạch nghiêng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển, là phản ứng dương tắnh.
+ Ure: môi trường giữ nguyên màu hồng nhạt, ure âm tắnh. + Lysine: môi trường giữ nguyên màu tắm, lysine dương tắnh.