2.1 ĐỐI TƢỢNG
Nghiên cứu về gen mã hóa kháng nguyên H5 và N1 của virus gây bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam đại diện một số địa phương được phân lập theo các năm 2004, 2005, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011. Mẫu bệnh phẩm đã được các Cơ quan thú y vùng kiểm tra bằng real-time PCR dương tính với virus cúm A/H5N. Sử dụng các mẫu bệnh phẩm có chứa virus làm nguồn nguyên liệu trực tiếp để tách RNA tổng số.
2.2 NỘI DUNG
1. Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên H5 một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011.
2. Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên N1 của một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011.
3. Phân tích so sánh tương đồng về nucleotide và amino acid suy diễn của gen H5 và N1, xác định mối quan hệ phả hệ với các chủng đăng ký trong Ngân hàng gen
2.3 VẬT LIỆU
Các mẫu bệnh phẩm là chất thẩm dịch (exudate) của niêm mạc của hầu họng- khí-phế quản, gan, não và lách có chứa virus cường độc cúm A/H5N1. Mẫu virus cúm
A/H5N1 đã được vô hoạt bằng nhiệt độ, bảo quản ở -80o
C. Danh sách các mẫu bệnh phẩm được liệt kê ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập giai đoạn 2004 - 2011
Số TT
Ký hiệu
viết tắt chủng Danh pháp quốc tế
Năm phân lập Nơi phân lập 1 DkQT801-2011 A/Duck/Vietnam/QT/801/2011 (H5N1) 2011 Quảng Trị 2 DkQT802-2011 A/Duck/Vietnam/QT/801/2011 (H5N1) 2011 Quảng Trị 3 CkKH-2010 A/Chicken/Vietnam/KH/2010 (H5N1) 2010 Khánh Hoà 4 Dk0970-09 A/Duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) 2009 Sóc Trăng 5 CkDT382-08 A/Chicken/Vietnam/DT382/2008 (H5N1) 2008 Đồng Tháp 6 CkKG88-08 A/Chicken/Vietnam/KG88/2008 (H5N1 2008 Kiên Giang 7 CkTV98-08 A/Chicken/VN/TV98/2008 (H5N1) 2008 Trà Vinh 8 DkNA72-07 A/Duck/Vietnam/NA72/2007 (H5N1) 2007 Quỳnh Lưu, Nghệ An 9 DkNA114-07 A/Duck/Vietnam/NA114/2007 (H5N1) 2007 Hưng Nguyên, Nghệ An 10 DkMB2-07 A/Duck/Vietnam/MB2/2007(H5N1) 2007 Gia Lâm, Hà Nội 11 DkAG-05 A/Duck/Vietnam/AG/2005 (H5N1) 2005 An Giang 12 CkVL-05 A/Chicken/Vietnam/VL/ 2005 (H5N1) 2005 Vĩnh Long 13 CkHD1-04 A/Chicken/Vietnam/HD1/2004 (H5N1) 2004 Hoài Đức, Hà Nội 14 MdGL-04 A/Mus Duck/Vietnam/GL/2004 H5N1) 2004 Gia Lâm, Hà Nội
2.4. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 2.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị 2.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Máy PCR PTC-100 (MJ. Research Inc., Mỹ). - Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin- Wealtec (Mỹ). - Bộ điện di ngang và nguồn điện di (Bio-Rad). - Box cấy vô trùng (laminar flow clean bench)
- Máy lắc có điều nhiệt; Máy ly tâm lạnh (hãng Eppendorf; |Máy hút chân không Speed-Vac; Máy khuấy từ, máy vortex, lò vi sóng, tủ lạnh -20oC và -80oC (SANYO- Nhật Bản), các bộ pipetman các loại của hãng Gilson (Pháp).
2.4.2. Hoá chất
- Các loại hóa chất: Yeast Extract (DIFCO-Mỹ), Trypton (DIFCO-Mỹ), EDTA, SDS, Tris (Sigma-Mỹ), Acid acetic (Merk-Đức), Kanamycin, Ampicilin (Merk-Đức), X-gal (Sigma-Mỹ), Agar (Sigma-Mỹ), Agarose (Sigma-Mỹ), Cồn tuyệt đối (Prolabo- Pháp)…
- Các loại mồi cho phản ứng PCR đặt mua của các hãng Sigma (Mỹ), Bioneer (Hàn Quốc).
- Các bộ kit tách chiết RNA tổng số, kit RT-PCR one- step, kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Qiagen.
- Bộ kit tách dòng TOPO-TA cloning của hãng Invitrogen.
- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp QIAprep Spin Miniprep của hãng Qiagen. - BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ). - Kit DyeEx dùng tinh sạch phản ứng giải trình tự (Qiagen),
- Các loại enzym giới hạn EcoRI, BamHI, NotI, SmaI, DraI… của các hãng New England BioLabs (Mỹ), Fermentas (Lithuania).
2.5. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS CÖM A/H5N1
Nghiên cứu, lưu giữ và phân tích đặc tính sinh học phân tử gen H5 và N1 của một số chủng virus cúm A/H5N1 từ gà, ngan, vịt ở Việt Nam bao gồm các bước: thu mẫu virus cúm theo các năm xảy ra dịch tại một số địa phương, tách chiết RNA tổng số và thu nhận toàn bộ gen H5 và N1 bằng RT-PCR, tách dòng và giải trình tự, xử lý
chuỗi gen, phân tích đặc điểm phân tử của các gen H5 và N1 thu được, xác định quan hệ nguồn gốc phả hệ, chẩn đoán dịch tễ học phân tử, tạo nguồn nguyên liệu để sản xuất vaccine thế hệ mới.
Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ sinh học với các trang thiết bị của phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, kết hợp với một số đơn vị trong nước và nước ngoài trong quá trình giải trình tự.
Qui trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ Hình 2.1.
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1.
2.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS CÖM A/H5N1
2.6.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
Trong mẫu bệnh phẩm gia cầm bị bệnh cúm A/H5N1 có chứa RNA của hệ gen virus và RNA của vật chủ. Huyễn dịch bệnh phẩm này được dùng làm nguyên liệu trực tiếp để tách RNA tổng số. Sử dụng bộ sinh phẩm tách RNA tổng số QIAamp Viral Mini Kit (Qiagen Inc.) theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất.
Tách ARN tổng số
Phản ứng RT- PCR
Giải trình tự trực tiếp Dòng hoá vào vector
pCR2.1 TOPO Thu nhận mẫu virus cúm A/H5N1
Truy cập Ngân hàng gen Tách chiết ADN plasmid
Giải trình tự ADN plasmid
Xử lý,thu nhận chuỗi gen
Phân tích so sánh đặc tính sinh học phân tử Xác định mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Dịch tễ học Định hướng sản xuất vaccine Tách ARN tổng số Phản ứng RT- PCR Giải trình tự trực tiếp Dòng hoá vào vector
pCR2.1 TOPO Thu nhận mẫu virus cúm A/H5N1
Truy cập Ngân hàng gen Tách chiết ADN plasmid
Giải trình tự ADN plasmid
Xử lý,thu nhận chuỗi gen
Phân tích so sánh đặc tính sinh học phân tử Xác định mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Dịch tễ học Định hướng sản xuất vaccine
2.6.2. Phƣơng pháp RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (hay còn gọi là phản ứng PCR ngược) là phản ứng nhân một đoạn khuôn RNA theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi RNA sợi đơn làm khuôn thành DNA hai sợi, sau đó qua giai đoạn thứ hai, dùng DNA hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành DNA phải nhờ vai trò của một loại enzym gọi là enzym phiên mã ngược. Trong nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 sử dụng phương pháp RT-PCR một bước với các cặp mồi được liệt kê ở Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT-PCR và chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.2 Danh sách các cặp mồi sử dụng trong thu nhận gen H5 và N1
Chuỗi gen
Tên
primer Trình tự chuỗi primer (5‟→ 3‟) Vị trí Độ dài (kb) H5 H5F 5‟-TCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTG-3‟ 1- 24 1,7 H5R 5‟-TTAAATGCAAATTCTGCATTG-3‟ 1776-1743 N1 N1F 5‟-ATGAATCCAAATCAGAAGATAATAAC-3‟ 1-26 1.4 N1R 5‟-CTACTTGTCAATGGTGAATGGC-3' 1398-1367 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR và chu trình nhiệt
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Chu trình nhiệt Số chu kỳ
Qiagen-onestep RT-PCR (5X) 10 500C - 60 phút 1
dNTP mix (10mmol/µl) 2 940C - 10 phút 1
Enzym mix 2 950C - 5 phút