10 11 18 61 69 87 1 0 2 1 0 4 0 1 1 3 6 1 1 4 0 1 4 9 1 5 6 0 1 7 7 1 1 1 7 2 1 7 8 1 7 9 0 1 9 2 0 0 2 0 5 2 1 6 8 2 2 2 3 5 2 4 2 2 4 3 6 5 2 2 8 5 2 9 3 2 9 8 3 2 6 1 3 4 3 4 5 3 7 5 4 6 2 4 7 3 1 4 9 5 2 4 5 2 9 5 4 4 5 4 9 2011 1 DkQT801-2011* S I H N K T A G N D D A S D N A K D I E R I K I I D H V R I K R D R K N M T V M
3.1.4. Phân tích vị trí điểm cắt protease, bám dính thụ thể, epitope và glycosyl hoá của gen kháng nguyên H5 trên cơ sở trình tự amino acid suy diễn
của gen kháng nguyên H5 trên cơ sở trình tự amino acid suy diễn
K Khhááii qquuáátt ccáácc vvịị ttrríí aammiinnoo aacciidd qquuyy đđịịnnhh đđặặcc ttíínnhhqquuaannttrrọọnngg ccủủaa ppoollyyppeeppttiiddee H H55,,ggồồmmvvịịttrrííggllyyccoossyyllhhooáá,,đđiiểểmmccắắttpprrootteeaassee((vvịịttrríítthhaayyđđổổiiccủủaacchhuuỗỗiinnốốiiHHAA11--HHAA22)),, v vịịttrrííbbáámmddíínnhhtthhụụtthhểểvvààeeppiittooppeeđđưượợcclliiệệttkkêêởởBBảảnngg 33..44.. B Bảảnngg33..44 CááccvvịịttrrííaammiinnooaacciiddqquuaannttrrọọnnggttrroonnggcchhuuỗỗiippoollyyppeeppttiiddeeHH55 Tên chủng virus cúm A/H5N1 Nƣớc/Lãnh thổ phân lập Clade Điểm cắt protease Vị trí bám dinh thụ thể Vị trí epitopes Vị trí glycosyl hoá thay đổi 338-345/346 238- 240 69 99-102 140-145 152-157 170-172
A/Duck/Vietnam/QT801/2011* Việt Nam 2.3.2.1 QRERRRK-R QSG K ANPA DHEASL PYQGSS DNA
A/Duck/Vietnam/QT802/2011* Việt Nam 2.3.2.1 QRERRRK-R QSG K ANPA DHEASL PYQGSS DNA
A/Hubei1/2010 Trung Quốc 2.3.2.1 QRERRRK-R QSG K ANPA DHEASL PYQGSS DNA
A/duck/Vietnam/TMU021/2009 Việt Nam 2.3.4.3 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGTP NNT
A/chicken/Viet Nam/TMU004/2008 Việt Nam 2.3.4.3 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGVP NNT
A/Vietnam/UT31394II/2008 Việt Nam 2.3.4.3 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGTP NNT
A/Duck/Vietnam/NA72/ 2007* Việt Nam 2.3.4.3 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGVP NNT
A/Duck/Vietnam/NA114/2007* Việt Nam 2.3.4.3 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGVP NNT
A/duck/Vietnam/50/2007 Việt Nam 2.3.4.3 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGVP NNT
A/Vietnam/HN31242/2007 Việt Nam 2.3.4.3 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGVP NNT
A/Fujian/1/2007 Trung Quốc 2.3.4 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASL PYQGMP NNT
A/Fujian/1/2005 Trung Quốc 2.3.4 LRERRRK-R QSG R ANPA DHEASS PYQGTP NNT
A/Chicken/Vietnam/KH/ 2010* Việt Nam 1.1 QREGRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/Duck/Vietnam/0970/ 2009* Việt Nam 1.1 QREGRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/Chicken/Vietnam/DT382/2008* Việt Nam 1.1 QREGRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/Chicken/Vietnam/KG88/2008* Việt Nam 1.1 QREGRRKKR QSG R ANPA SHEASL PYQGKS NST
A/Ck/Vietnam/TV98/2008 * Việt Nam 1.1 QREGRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/duck/BacLieu/07-09/2007 Việt Nam 1.1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST A/Duck/Vietnam/Camau/498A/2006 Việt Nam 1.1 QREGRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST A/Muscovy Duck/Vietnam/ BenTre/
342/2006 Việt Nam 1.1 QREGRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST A/Chicken/Thailand/CU-354/2008 Thái Lan 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/Duck/Vietnam/MB2/ 2007* Việt Nam 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/Thailand/NBL1/2006 Thái Lan 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST A/Vietnam/CL2009/2005 Việt Nam 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/Duck/Vietnam/AG/2005* Việt Nam 1 QKERRRKKR QSG R VNPV SHEASL PYQGKS NST
A/Chicken/Vietnam/VL/ 2005* Việt Nam 1 QKERRRKKR QSG R VNPV SHEASL PYQGKS NST
A/Chicken/Vietnam/HD1/2004* Việt Nam 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST
A/Muscovy Duck/Vietnam/GL/2004* Việt Nam 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST A/Vietnam/1194/2004 Việt Nam 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST A/Vietnam/1203/2004 Việt Nam 1 QRERRRKKR QSG R ANPV SHEASL PYQGKS NST A/Duck/Vietnam/1/2005 Việt Nam 0 QRERRRKKR QSG R ASPA NHDASS PYLGRS NST A/HongKong/156/1997 Hồng Kông 0 QRERRRKKR QSG R ASPA NHDASS PYLGRS NSA
A/Goose/Guangdong/1/1996 Trung Quốc 0 QRERRRKKR QSG R ASPA NHDASS PYHGRS NSA
Ghi chú: Các chủng có ký hiệu (*) là chủng được phân lập và xác định trong nghiên cứu này.
Các vị trí glycosyl hóa trong gen H5:
Phân tích toàn bộ chuỗi gen mã hóa kháng nguyên H5 gồm 568 amino acid của phân dòng Quảng Đông (clade 1), 567 amino acid phân dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4)
và clade 2.3.2 của 33 chủng (gồm 26 chủng của Việt Nam, 5 chủng của Trung Quốc, 2 chủng của Thái Lan, trong đó có 14 chủng cường độc trong nghiên cứu được phân lập giai đoạn 2004 - 2011, cho thấy có các vị trí glycosyl hoá được ký hiệu bằng chữ số La mã I-VII, trong đó 5 vị trí có trong chuỗi HA1 và 2 vị trí trong HA2 (Hình 3.3). Glycosyl hoá ở 6 vị trí hoàn toàn giống nhau, đó là các vị trí I (NNS), II (NVT), IV (NNT), V (NSS), VI (NGT), VII (NGS) (Hình 3.3). Hiện tượng glycosyl hoá giữa các phân dòng này, chỉ khác biệt ở vị trí thứ III (amino acid 170-173), đó là:
- Đối với 2 chủng thuộc clade 2.3.2, đúng hơn là clade mới xuất hiện 2.3.2.1 (A/Dk/VN/QT801/2011(H5N1) và A/Dk/VN/QT802/2011(H5N1)) không có hiện tượng glycosyl hoá tại vị trí này, mà thay thế vào đó là các amino acid DNA (D (aspartic acid), N (asparagine) và A (alanine)) và không giống như ở các chủng thuộc clade 2.3.4 và 2.3.2 (Bảng 3.4). Như vậy, 2 chủng này chỉ có 6 vị trí glycosyl hoá.
- Các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông là các amino acid NST, trong khi
các chủng phân dòng Phúc Kiến là NNT. Các chủng phân dòng Phúc Kiến có thay đổi
glycosyl hoá tại vị trí III, gồm 7 chủng: A-VN-08(HM114593), DkNA72-07, DkNA114-07, Dk-VN50-07(CY029711),A-VN-07(EU294370), A-FJ1-07(FJ492883), A-FJ1-05(FJ492882), trong đó có 2 chủng DkNA72-07 và DkNA114-07 nằm trong nhóm nghiên cứu (Hình 3.3).
Hiện tượng ”lệch kháng nguyên” sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã cho amino acid Asparagine (N) tạo tiền đề cho glycosyl hoá. Glycosyl hoá rất dễ xảy ra trong thành phần kháng nguyên của chuỗi polypeptide HA và NA. Glycosyl hoá xảy ra nhiều hơn ở phần protein H5 đầu N (-NH2) trong HA1 so với trong HA2, do HA1 là phần polypeptide nhô lên bề mặt, từ đó suy luận HA1 chịu trách nhiệm về đặc tính kháng nguyên nhiều hơn so với HA2.
Vị trí bám dính thụ thể và các vị trí epitope trong gen H5:
- Xem xét vị trí vùng bám dính thụ thể của tất cả các chủng đều có cấu trúc là QGS không thay đổi.
- Vị trí epitope ở 2 chủng DkQT801-2011 và DkQT802-2011 có sự khác biệt tại vị trí 69 là K và giống với chủng A/Hubei1-2010, trong khi tất cả các chủng còn lại là
R (Bảng 3.4). Vị trí 99-102 của các chủng đã xuất hiện tại Việt Nam từ 2004 đến nay là ANPA, khác biệt với 3 chủng nhóm cổ điển thuộc clade 0 (Gs-GD1-96, A-KH156-97 và DkVN1-05) có cấu trúc là ASPA. Vị trí epitope 140-145 của các chủng ở Việt Nam
thuộc clade 2.3.2 (và 2.3.2.1), 2.3.4 và 1 (và 1.1), chủ yếu là DHEASL và SHEASL,
sai khác chủ yếu tại vị trí D140S, khác biệt hoàn toàn với các chủng cổ điển (NHDASS) (Bảng 3.4). Epitope tại các vị trí 152 - 157, thể hiện sự sai khác ở các amino acid cuối, với cấu trúc là PYQGSS của chủng DkQT801-2011 và DkQT802- 2011 mới phát hiện 2011 tại phía bắc Việt Nam cùng với A/Hubei1-2010, hoặc
PYQGTP (chủng A-VN-UT31394II-08) hoặc PYQGVP (chủng Ck-VN-TMU004-08)
hoặc PYQGKS (chủng A-VN-1194-04) và PYHGRS (chủng cổ điển Gs-GD1-96)
(Bảng 3.4). Điều quan tâm lớn nhất là đại đa số các chủng cổ điển trước 1997 được làm giống gốc vaccine, trong đó có một số vaccine nhập ngoại đang được sử dụng tại nước ta: (vaccine H5N1: chủng gốc là A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1), và vaccine H5N2 chủng gốc là A-Turkey-ENG-N28(73)(H5N2. Hiện nay, 2 chủng A-VN-1194(04) và A-VN- 1203(04) đã được WHO khuyến cáo sử dụng làm nguyên liệu gốc để cung cấp nguồn gen HA và NA đã được cắt bỏ vùng độc bằng phương pháp di truyền ngược để kiến tạo giống gốc vaccine, trong đó có giống gốc NIBRG-14.