35 Mồi xuôi (10pmol/µl) 2 55 0 C 1 phut
2.8. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE
Giải trình tự (DNA sequencing) là quá trình thu nhận và xác lập trình tự nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Nguyên lý của phương pháp giải trình tự là dựa vào hoạt động của DNA-polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mạch đơn, gắn nucleotide vào vị trí 3‟-OH tự do, nếu đó là nucleotide không chứa
nhóm 3‟-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp
này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng
một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide, sau khi phân tích sẽ cho một dãy có độ dài vài trăm nucleotide.
Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20-24 nucleotide, và chuỗi đơn DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5‟→ 3‟, được dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu. Khi sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình tự, phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềm tin-sinh học, thì thu nhận được chuỗi DNA cuối cùng.
Nếu giải trình được thực hiện trên máy giải trình tự tự động (Automated Sequencer, ABI-3100 Avant Gentic Analyzer), thì mỗi một lần giải trình, chuỗi thô (chuỗi có thành phần nucleotide ban đầu chưa được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm đến dưới một nghìn, thông thường là 500-700 nucleotide.
Có hai phương pháp: i) Nếu giải trình tự trực tiếp, tức là từ đoạn DNA sản phẩm PCR/RT-PCR sau tinh sạch, thì mồi đơn (mồi xuôi hoặc mồi ngược) sử dụng chính là mồi hai đầu biên tham gia phản ứng PCR/RT-PCR hoặc bám vào bên trong chuỗi nucleotide của sản phẩm, ii) Nếu DNA đưa vào giải trình tự là DNA plasmid vector tái tổ hợp chứa đoạn chèn PCR ngoại lai, thì mồi là chuỗi nucleotide bám ở vector ngoài vùng biên hai đầu đoạn DNA ngoại lai được gài vào. Mồi dùng để giải trình tự DNA plasmid tái tổ hợp được dùng nhiều nhất là M13F (mồi xuôi) và M13R (mồi ngược).
Ngoài ra, do gen mã hóa kháng nguyên H5 có độ dài 1,7kb và gen mã hóa kháng nguyên N1 có độ dài 1,4kb, mỗi một chuỗi đọc trình tự thu nhận thông thường khoảng 500 – 700 nucleotide, đôi khi chuỗi còn cho chất lượng không tốt ở vùng giữa của vị trí giao nhau của toàn bộ chuỗi gen thì cần phải sử dụng mồi đọc trình tự của vùng giữa giao nhau của gen. Trong nghiên cứu này, cặp mồi được sử dụng cho gen H5 là mồi H307F (vị trí 307-328) và mồi của gen N1 là mồi N1F2 (vị trí 436-457 (Bảng 2.4).
Bảng 2.4 Danh sách các cặp mồi sử dụng trong đọc trình tự gen H5 và N1
Tên primer Trình tự chuỗi primer (5‟→ 3‟) Vị trí
M13F (mồi xuôi) GTAAAACGACGGCCAG 205 - 221
M13R (mồi ngược) CAGGAAACAGCATTGAC 391-406
H307F (gen H5) AATGACCTCTGTTACCCAGG 307-328
N1F2 (gen N1) GGAGGAACAACATACTGACAACTC 436-457
- Thành phần phản ứng giải trình tự và chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.5.
Bảng 2.5 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự
Thành phần phản ứng Chu trình nhiệt
Big-Dye 1 l
Primer (1pmol) 1,6 l Template 1,5 l Nước tinh khiết 5,9 l Enhancer 1x 10 l
Tổng cộng 20 l
Sản phẩm của phản ứng đọc trình tự trong nghiên cứu được tinh sạch, đông khô và gửi đọc trình tự trên máy tự động ABI-3100 Avant Gentic Analyzer (Mỹ) có tại Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) hoặc gửi đọc trình tự tại Hàn Quốc.