29. A/Muscovy Duck/Vietnam/GL/2004 (H5N1) MdGL-04* Ngan 2004 Việt Nam EF05
A-VN(05)EF : A V : 568 A-FJ1(05)F : T A V :
A-FJ1(05)F : ...T...A....V...- : 567 DkAG-05 : ...A....I...- : 568 CkVL-05(17 : ...A....I...- : 568 DkVN1(05)D : .M.T...A....V...- : 568 CkHD1-04-E : ...A....V...- : 568 MdGL-04 : ...A....V...H...- : 568 A-VN-1194- : ...A....V...- : 568 A-VN-1203- : ...A....V...- : 568 A-HK156(97 : .M.T...A....V...- : 568 GsGD1(96)A : .M.T...A....V...- : 568
Hình 3.3: Trình bày so sánh trình tự amino acid chuỗi polypeptide H5 của 33 chủng (có 14 chủng phân lập giai đoạn 2004-2011 tại Việt Nam thuộc nghiên cứu này) với các chủng liên quan có trong Ngân hàng gen, danh sách các chủng được liệt kê ở Bảng 3.1. So sánh trình tự nucleotide được trình bày ở Phụ lục 1).
Ghi chú: dấu (.) biểu thị giống với các trình tự amino acid tương ứng của chuỗi H5 đầu tiên
(DkQT801-2011). Sự sai khác về amino acid được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng. Phần amino acid tham gia vào điểm cắt của protease được đóng khung lớn. Mũi tên chỉ hướng phân định của HA1-HA2. Các vị trí glycosyl hoá được đóng khung nhỏ và đánh số La mã từ I đến VII. Vùng chịu trách nhiệm bám dính thụ thể (receptor-binding) được bôi đậm. (-) ký hiệu của bộ mã kết thúc (stop codon). Các chủng trong nghiên cứu được gạch bên dưới.
Điều đặc biệt cần chú ý là, các chủng trong nghiên cứu được phân lập trong 3 năm gần đây (các năm 2008-2009-2010), gồm các chủng CkDT382-08, CkKG88-08, CkTV98-08, Dk0970-09 và CkKH-2010, mặc dù là nhóm các chủng đại diện nằm ở một số địa danh thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long và duyên hải miền Trung, nhưng đã có sự biến đổi nucleotide để tạo thành một nhóm khác biệt so với một số chủng trong vùng, được phân lập những năm trước đó (Phụ lục 1). Sự sai khác tìm thấy ở 22 vị trí, bao gồm: 10 vị trí G↔↔A (191, 405, 660, 1021, 1086, 1494, 1503, 1566, 1578, 1585), 5 vị trí T↔↔C (474, 933, 942, 944, 1408), 3 vị trí C↔↔T (177, 642, 1134), 3 vị trí A↔↔G (1131, 1262, 1383) và 1 vị trí T↔↔G (189).
Đối với thành phần nucleotide của vùng mã hoá cho các amino acid tại điểm cắt protease, các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông có gen H5 kích thước 1707 bp, gồm 15 nucleotide tại vị trí 1021-1035, trong khi đó, ở một số chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến và phân dòng Thanh Hải, gen H5 thiếu hụt 3 nucleotide (AAG) chỉ còn 1704 nucleotide. Tất cả gen H5 của 14 chủng đều có bộ mã khởi đầu là ATG (methionine), bộ mã kết thúc là TAA hoặc TAG (Phụ lục 1).
So sánh trình tự amino acid chuỗi polypeptide H5 của 33 chủng (có 14 chủng thuộc nghiên cứu này, phân lập năm 2004-2011 tại Việt Nam) với các chủng liên quan có trong Ngân hàng gen được trình bày ở Hình 3.3. Kết quả cho thấy: có 41 vị trí sai
khác lớn về amino acid giữa các chủng được so sánh.Các sai khác tập trung chủ yếu ở HA1 gồm 32 vị trí (10, 11, 18, 61, 69, 96, 102, 104. 110, 136, 140, 149, 156, 170, 171, 172, 178, 179, 190, 200, 205, 216, 228, 235, 242, 243, 256, 285, 293, 298, 326, 341) và HA2 chỉ có 9 vị trí (345 375, 462, 473, 491, 524, 529, 544, 549) (Hình 3.3).
Trình tự amino acid ở chuỗi nối HA1-HA2 của các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông (bao gồm dãy amino acid -RRRKK-), đã có sự sai khác đáng chú ý tại vị trí 341 - 345, tạo nên sự khác biệt sắp xếp amino acid tại điểm cắt protease (Bảng 3.2). Từ năm 2006 đến nay, nhóm các chủng của vùng đồng bằng sông Cửu Long đã có sự thay thế amino acid tại vị trí 341 từ arginine thành glycine (R341G), tạo nên chuỗi nối (-GRRKK-). Trong khi đó, các chủng phân dòng Phúc Kiến và phân dòng Thanh Hải, amino acid arginine (R) vẫn giữ nguyên tại vị trí 341, nhưng thiếu hụt một amino acid Lysine (K) sau đó, chỉ còn lại (-RRRK-). Như vậy, tất cả các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông giai đoạn năm 2004 - 2005, chuỗi nối của HA1-HA2 thông thường có motif (-RRRKK-) trong khi các chủng phân dòng Phúc Kiến và phân dòng Thanh Hải lại có motif là (-RRRK-) do trong thành phần nucleotide bị mất một bộ mã AAG (mã hóa amino acid K) (Hình 3.3).
Kết quả so sánh thành phần amino acid ở Bảng 3.3 cũng cho thấy, chủng đại diện vùng duyên hải miền Trung (CkKH-2010) và các chủng vùng đồng bằng sông Cửu Long (Dk0970-09, CkDT382-08, CkKG88-08, CkTV98-08, DkCaM-06, MdBentre-06) có sự khác biệt tại các vị trí: R64K, D184N (ngoại trừ chủng Dk0970),
G341R, V529I hoặc V529T.
Một số amino acid được coi là các vị trí có liên quan đến khả năng bám dính thụ thể (vị trí amino acid 226 và 228). Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [116], [121]. Vị trí amino acid 226 của HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu. Ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine (G), thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic
2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của loài chim và gia cầm.
Đối với gen HA (H5) sự đột biến giãn nở chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hóa cho các amino acid kiềm (arginine và lysine) có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực của virus và ở các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông thường có motif là (-RRRKK-) [39], [86] còn ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến có chuỗi nối là (-RRRK-) [9].
So sánh hai chủng thuộc clade 2.3.2.1 mới phân lập là DkQT801-2011 và DkQT802-2011 với các chủng của Việt Nam và thế giới, cho thấy 2 chủng này tương đồng với chủng ở người của Trung Quốc là A/Hubei1-2010 và đã tạo nên sự khác biệt hoàn toàn cả về thành phần nucleotide lẫn amino acid của gen H5. Một số sai khác đặc trưng cho các chủng mới phân lập này bao gồm I10S, Q18H, D61N, R69K, I87T, D104G, S136D, N170D, T172A, R178K, S179D, A200E, K205R, V235I, V235I, M242I, N256H, K293R, E375D, K462R, R473K, D491N, L524M, A544V, V549M (I: Isoleucine, S: Serine, Q: Glutamine, H: Histidine, D: Aspartic acid, N: Asparagine, R: Arginine, K: Lysine, T: Threonine, G: Glycine, A: Alanine, E: Glutamic acid, V: Valine, L: Leucine, M: Methionine) (Bảng 3.3). Một số biến đổi tại nhiều vị trí tạo nên các amino acid giống với các chủng cổ điển dòng Quảng Đông những năm 1996 - 1997.
Bảng 3.3: Kết quả tổng hợp phát hiện 41 vị trí sai khác về amino acid của gen kháng nguyên H5 so sánh ở 33 chủng phân lập từ năm 2004 - 2011. Năm Số T T Tên chủng
Các vị trí sai khác amino acid của H5