Nối sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng

35 Mồi xuôi (10pmol/µl) 2 55 0 C 1 phut

2.7.1. Nối sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng

Dòng hóa là quá trình đưa đoạn DNA ngoại lai (sản phẩm RT-PCR) gắn vào trong hệ gen của một vòng DNA đã được thiết kế sẵn gọi là plasmid, nhằm tạo ra vector tái tổ hợp. Sau đó plasmid chứa DNA ngoại lai này được chuyển nạp (transformation) vào tế bào khả biến (competent cell) để nhân lên với số lượng lớn và tách DNA plasmid chứa sản phẩm PCR chèn vào (gọi là plasmid tái tổ hợp). Nếu sản phẩm PCR có độ dài ngắn (dưới 2 kb), thông thường dễ dàng được gắn trực tiếp vào vector tách dòng theo cơ chế bổ sung adenin (A) của đầu 3‟ ở sản phẩm PCR với Thymin (T) ở đầu 3‟ của vector (plasmid) đã được thiết kế theo cơ chế tách dòng TA. Plasmid được sử dụng nhiều hiện nay là loại vector pCR2.1-TOPO của hãng Invitrogen (Hình 2.2).

.

Hình 2.2 Cấu trúc của vector pCR2.1- TOPO (Invitrogen Inc.)

Vector pCR2.1- TOPO có kích thước là 3,9 kb, được thiết kế có hai

site) của vector. Các đoạn DNA của sản phẩm của phản ứng PCR/RT-PCR, được gắn thêm một nucleotide Adenin (A) ở cuối đầu 3‟ nhờ enzym Taq DNA-polymerase. Các nucleotide này sẽ liên kết bổ sung với các nucleotide Thymin của vector trong quá trình ghép-nối sản phẩm PCR vào vector tạo thành một plasmid tái tổ hợp đóng vòng

khép kín. Tại hai đầu của vùng MCS, có bố trí điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI để

thuận lợi cho quá trình kiểm tra sản phẩm tách dòng.

Ngoài ra, vector pCR2.1-TOPO cũng chứa các gen mã hoá cho các protein enzym cần thiết trong qua trình chọn lọc các plasmid tái tổ hợp (gen kháng kháng sinh, operon-lac), các điểm khởi đầu sao chép như các vector tách dòng khác. Operon-Lac

chứa gen mã hoá cho enzym -galactosidase (lacZ) nằm trong vùng MCS, có khả năng

thuỷ phân một loại cơ chất sinh màu là X-gal. Nếu sản phẩm PCR được gắn vào vector thì sẽ làm bất hoạt gen lacZ. Do đó, các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên

khuẩn lạc màu trắng, còn các vi khuẩn mang vector pCR2.1- TOPO không mang gen

ngoại lai sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh.

Thành phần phản ứng:

Vector pCR2.1TOPO: 1 µl

Nước tinh khiết: 2 µl

Sản phẩm PCR: 2 µl

Dung dịch muối: 1 µl

Tổng số: 6 µl

Để ở nhiệt độ phòng (15 - 25o

C) trong 5 phút. Tiến hành chuyển nạp.