4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp
hợp protease của chủng B. subtilis N18
2.3.16.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ Cám mì và Bột đậu nành
Tiến hành nuôi VK trên MT3 với 10g MT trong bình tam giác 250ml có bổ sung cám mì và bột đậu nành với các tỉ lệ khác nhau theo Bảng 2.2
Bảng 2.2. Tỉ lệ cám mì và bột đậu nành trong MT nuôi cấy B.subtilis N18
TN Cám mì (%) Bột đậu nành (%) 1 0 100 2 30 70 3 40 60 4 50 50 5 60 40 6 70 30 7 100 0
Với thời gian lên men là 48h, nhiệt độ lên men 370C và độ ẩm MT ban đầu 60% Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến mục 2.3.13. Chọn nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt độ protease cao.
(A1 – A2).d 0,01.t.v FU =
52
2.3.16.2. Phương pháp xác định lượng nước cho vào ở các độ ẩm cần thiết và khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường
Cách tính lượng nước cho vào 1 kg nguyên liệu gồm bột đậu nành và cám mì thực hiện theo công thức sau:
Nguyên liệu ban đầu có độ ẩm trung bình: 10%
a: Lượng nước cần thiết cho vào với các độ ẩm cần thiết (lit) ma = 1 ( 100% độ ẩm)
mb= 0,1 ( Độ ẩm của nguyên liệu) m: Độ ẩm cần thiết
Vd: Để có độ ẩm MT là 60% lượng nước cho vào 1 kg nguyên liệu là (0,1 – 0,6)/ (0,6 – 1) = (- 0,5)/(- 0,4) = 1,25
Vậy cần 1,25 lít nước cho vào 1 kg nguyên liệu.
Tiến hành khảo sát với các độ ẩm 40, 50, 60, 70, 80% để xác định độ ẩm tối ưu cho sự sinh tổng hợp protease cao.
2.3.16.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men
- Tiến hành nuôi VK trên MT theo kết quả của TN 2.3.16.2.
- Bổ sung Nấm men vào MT nuôi cấy với các nồng độ 0,1 ; 0,2 ; 0,3%, mẫu đối chứng là VK nuôi trong MT không bổ sung Nấm men.
- Xác định hoạt độ protease theo phương pháp mục 2.3.13. Chọn nồng độ nấm men thích hợp cho hoạt tính protease cao nhất.
2.3.16.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
- Nuôi VK trong MT theo mục 2.3.16.3
- Chỉnh pH ban đầu ở các mức: 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12
- Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm loại bỏ sinh khối ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch enzyme. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến.
- Dựa vào kết quả thu được xác định pH thích hợp cho quá trình lên men.
2.3.16.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống
* Mục đích:xác định tỉ lệ cấy giống tối ưu vào MT để thu được prptease có hoạt tính cao nhất.
a = mb - m m - ma
53
* Cách tiến hành:
- Nhân giống trong môi trường lỏng (MT1 không có agar), 20ml môi trường trong bình tam giác 250ml, nuôi trên máy lắc ngang 120 vòng/ phút, nhiệt độ 37oC, thời gian nuôi 14 giờ
- Chuẩn bị các bình tam giác 250ml chứa 10g các MT có bổ sung NaCl 0,5% , NaCl 0,5% + 0,1% nấm men trích ly, đối chứng là MT không bổ sung NaCl và nấm men trích ly. Hấp khử trùng ở 1atm/1 giờ.
- Giống cấy các nồng độ 107
và 108 ở từng nghiệm thức - Lên men tiến hành ở nhiệt độ 37oC, thời gian nuôi 48 giờ - Đánh giá kết quả theo hoạt tính protease
2.3.16.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K +
- Tiến hành nuôi VK trên MT theo kết quả TN 2.3.16.5 - Bổ sung thêm nguyên tố khoáng được thay đổi là Zn2+
, K+. - Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến.
- Dựa vào kết quả thu được, chọn vi khoáng phù hợp cho hoạt tính protease cao nhất.
2.3.16.7. Ảnh hưởng thời gian lên men
- Tiến hành lên men bán rắn trên MT đã tối ưu theo mục 2.3.16.6. Ở nhiệt độ 37o C, từng khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
- Lấy mẫu phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Anson cải tiến ( mục 2.3.13) và PP đếm khuẩn lạc (mục 2.3.11)
- Dựa vào kết quả thu được, chọn mốc thời gian phù hợp cho hoạt tính protease cao nhất.
2.3.16.8. Tối ưu hóa nồng độ Tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm
Để xác định nồng độ Tween 80 và Glucose thích hợp cho lên men, chúng tôi tiến hành quy hoach thực nghiệm với hai yếu tố là nồng độ Tween 80 và nồng độ Glucose. Chúng tôi sử dụng phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để đưa ra phương trình hồi quy.
Các mức tiến hành thí nghiệm được bố trí như Bảng 2.3
Bảng 2.3. Các mức tiến hành thí nghiệm
54
Glucose (%) Tween 80 (%)
Mức tâm 2,5 0,03
Khoảng biến thiên 1,5 0,01
Mức trên ( +) 4 0,02
Mức dưới ( -) 1 0,04
Tiến hành các TN theo bảng 2.4
Số TN tối ưu là 11 tí nghiệm, trong đó có 3 TN ở tâm phương án với các điều kiện ban đầu được cố định như:
- Tỉ lệ Cám mì/ Bột đậu nành: 7/3 - Nhiệt độ nuôi cấy: 370
C - Thời gian nuôi cấy: 48 giờ - pH ban đầu: 9
Bảng 2.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm. TN x1 x2 x1 (%) x2 (%) 1 -1 -1 1 0,02 2 1 -1 4 0,02 3 -1 1 1 0,04 4 1 1 4 0,04 5 -1 0 1 0,03 6 1 0 4 0,03 7 0 -1 2,5 0,02 8 0 1 2,5 0,04 9 0 0 2,5 0,03 10 0 0 2,5 0,03 11 0 0 2,5 0,03
Phương trình hồi quy có dạng:
y = b0 + b1x1 + b2x2 + b11x12 + b22x22 + b12 x1x2 Trong đó:
y: Hàm mục tiêu cần tối ưu
x1: Biến ngẫu nhiên, nồng độ glucose x2: Biến ngẫu nhiên, nồng độ tween 80
b0, b1, b2, b11, b22, b12: Hệ số của phương tình hồi quy. Thông số khảo sát: Hoạt tính protease