4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến
a. Nguyên tắc [10]
Cho protease tác dụng với casein, sau đó kết tủa protease dư thừa bằng TCA. Sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay các acid amin, trong các acid amin thì tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt độ enzyme theo định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính protease là lượng enzyme cần để thủy phân casein trong thời gian 60 phút tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg tyrosine trong 1 ml dịch lọc ở 370
C và pH 7
b. Hóa chất
- Đệm phosphate 0,2M: Cho từ từ dung dịch NaH2PO4 0,2M vào dung dịch Na2HPO4 0,2M và khuấy đều cho đến khi đạt pH 6.
- Casein 1,5%: 1,5g casein + 25 ml NaOH 0,1M, đun cách thủy ở 90 – 950C trong 10 phút. Làm mát, chỉnh về pH 7 bằng H3PO4 1/30M. Thêm 20 ml đệm phosphate 0,2M và định mức dung dịch để đạt đến 100 ml bằng nước cất.
48
c. Dựng đường chuẩn Tyrosine
Hòa tan 10 mg tyrosine trong 80 ml, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch HCl 0,1M đến vạch
Thực hiện một loạt 6 ống nghiệm như sau:
Ống nghiệm AS0 AS10 AS20 AS30 AS40 AS50
Dung Dịch Tyrosine (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Lượng Tyrosine tương ứng 0 10 20 30 40 50
HCl 0,1M (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Na2CO3 0,4M 5 5 5 5 5 5
Folin(ml) 1 1 1 1 1 1
Lắc đều các ống nghiệm này, đặt vào bể ổn nhiệt 370C trong 20 phút. Đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm
d. Tiến hành phản ứng
Cho 1 ml casein 1,5% vào ống nghiệm , ủ 370
C trong 10 – 15 phút. Cho 1 ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, đem ủ 370C trong 60 phút. Sau đó cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M, để ổn định trong 25 phút, lọc bỏ tủa. Cho 5 ml Na2CO3 0,4m vào 1ml dịch lọc , thêm 1ml Folin. Trộn đều, để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm.
Với mẫu đối chứng, lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml enzyme và tiến hành các bước tương tự như trên.
e. tính toán kết quả
Hoạt tính protease được tính theo công thức:
F = (10/(AS10 – AS0) + 20/(AS20 – AS0) + ... + 50/(AS50 – AS0))/5 Trong đó:
A: Độ hấp thụ của mẫu
A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng
F: Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine (µg) và độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm
n : Hệ số pha loãng enzyme UI =
(A – A0) x F x n 100
49 1/100: Hệ số chuyển đổi.