4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto
* Nguyên tắc [14]
- Tách rời các tế bào vi khuẩn Chế phẩm natto của Nhật Bản
Chủng Bacillusđược chọn
Thử nghiệm catalase Định danh bằng sinh học phân tử Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy( độ ẩm, thời gian, pH, tỉ lệ giống…) đến hoạt tính protease. Phân lập chọn chủng Bacillus Sấy khô Nghiền Lên men Nhân giống Giữ giống Thành phần MT( bột đậu nành, cám mì, muối khoáng…) Hoạt tính enzyme VSV lạ (E.coli, Salmonella) Tiêu chuẩn hóa chất lượng
Nhuộm Gram
41
- Nuôi cấy các tế bào trong MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, tách biệt nhau.
* Cách tiến hành
- Lấy 10g natto của Nhật Bản giã nhỏ trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác có 90ml nước muối sinh lý, lắc đều tạo huyền phù, được dung dịch pha loãng 10-1.
- Lắc đều, hút 1 ml dung dịch 10-1cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý, ta được dịch pha loãng 10-2. Cứ tiếp tục pha loãng như thế được dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 , 10-8
- Từ dịch pha loãng 10-7, 10-8, nhỏ 0,1 ml (ở mỗi nồng độ) vào đĩa petri có sẵn MT1. Dùng que trang trải đều dung dịch khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que trang đó trải tiếp 2 đĩa tiếp theo (mỗi nồng độ 3 đĩa).
- Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h – 48h. Chọn những KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng[10].
* Phương pháp làm thuần [13]
- Lấy 1 KL riêng rẽ trên ống thạch nghiêng hòa vào nước cất vô trùng, trải lên đĩa lần 2. Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới KHV đều có 1 dạng tế bào, chứng tỏ giống phân lập đã thuần khiết.
- Sau đó chọn các KL riêng rẽ cấy chuyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa.
* Yêu cầu:Chủng phân lập được phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết [4].