4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử
45
- Phá màng TB và màng nhân bằng protein đặc hiệu (protease K) để giải phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
- Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: Sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA.
- Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu được các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.
* Chạy PCR (polymerase chain reaction)
Nguyên tắc:Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước.
- Bước 1: (Biến tính): Trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 94o
C - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2 (Lai): Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40o
C – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 3(Tổng hợp): Nhiệt độ được tăng lên đến 720C để DNA polymerase
hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
* Giải trình tự DNA
- Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): Dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh lệch nhau một nucleotide.
- Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau một nucleotide.
Ở cả hai phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. Sau khi giải trình tự gen 16S rRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến loài chủng VK nghiên cứu.