4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm
Các chất hoạt động bề mặt (surfactant inclusions) có vai trò quan trọng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, glucose cung cấp nguyên liệu ban đầu để vi sinh vật phát triển trước khi tổng hợp được các enzyme để phân giải glucose từ nguồn tinh bột có trong môi trường. Egwin et al.,(2012)[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt như tween 80, acetonitrile cho vào môi trường nuôi cấy B.subtilis đến lượng protease sinh ra. Kết quả thấy rằng cho tween 80 vào môi trường thì lượng protease tăng lên 5 lần và enzyme có tính ổn định hơn ở nhiệt độ 50-60o
C.
Sự phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố và chúng ta cần phải xem sự tác động của những yếu tố đó như thế nào. Hoạt tính của enzyme thu được không chỉ bị ảnh hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu tố với nhau. Vì thế, nếu chỉ dựa trên những nghiên cứu rời rạc để đưa ra giá trị tối ưu thì kết quả sẽ không đạt được độ chính xác cao.
Để quá trình nuôi cấy vi khuẩn B.subtilis N18 đạt hiệu quả và đánh giá chính xác, toàn diện hơn về ảnh hưởng của từng yếu tố Tween 80 và Glucose cũng như ảnh hưởng đồng thời của hai yếu tố này đến hoạt tính enzyme protease, chúng tôi nuôi chủng VK
B.subtilisN18 trên môi trường theo mục 3.4.7, đồng thời tiến hành thí nghiệm theo phương
pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là hoạt tính enzyme protease [27][36][37].
79
Chúng tôi thay đổi đồng thời hai yếu tố khảo sát là nồng độ Tween 80 và Glucose, từ đó xác định quy luật ảnh hưởng của hai yếu tố này đến hàm mục tiêu. Trên cơ sở đó chúng tôi sẽ chọn ra các thông số tối ưu. Số thí nghiệm tối ưu là 11 thí nghiệm, trong đó 3 thí nghiệm ở tâm phương án. Hàm mục tiêu là hoạt tính enzyme protease y .
Các giá trị khảo sát của hai yếu tố tối ưu như sau:
- x1 là nồng độ Glucose với khoảng khảo sát là 1 – 4%, mức tâm là 2,5%, khoảng biến thiên là 1,5%
- x2 là nồng độ Tween 80 với khoảng khảo sát là 0,02 – 0,04%, mức tâm là 0,03%, khoảng biến thiên là 0,01%.
Kết quả của thí nghiệm tối ưu nồng độ Tween 80 và glucose với hàm mục tiêu là hoạt tính enzyme protease được trình bầy trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm và kết quả TN X1 x2 x1 (%) x2 (%) y (U/g) 1 -1 -1 1 0,02 258,72 2 1 -1 4 0,02 222,87 3 -1 1 1 0,04 47,16 4 1 1 4 0,04 291,67 5 -1 0 1 0,03 195,42 6 1 0 4 0,03 300,71 7 0 -1 2,5 0,02 234,50 8 0 1 2,5 0,04 156,01 9 0 0 2,5 0,03 281,01 10 0 0 2,5 0,03 287,15 11 0 0 2,5 0,03 282,30
Sử dụng chương trình Modde 5.0 để giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và kiểm định sự tương thích của các hệ số hồi quy và phương trình. Các kết quả được thể hiện ở bảng 3.15.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ tween 80 và glucose đến hoạt tính protease của chủng B.subtilis N18
Y Coeff. SC Std. Err P
Constant 273,954 8,37476 5,01693e-007
80 x2 -36,8755 6,66483 0,00264498 x1 x1 -11,5939 10,2569 0,309617 x2 x2 -64,4044 10,2569 0,00150484 x1 x2 70,0907 8,16271 0,000353221 N = 11 Q2 = 0,847 RSD = 16,3254 DF = 5 R2 = 0,977 Conf. lev. = 0,95
Hệ số in nghiêng là hệ số không có ý nghĩa
(Coefficients: Các giá trị của hệ số; Std.Err: Sai số chuẩn; P (P – value): Giá trị của hệ số; R2: Độ biến thiên thực; Q2: Độ biến thiên ảo; Conf. lev.: Mức ý nghĩa; DF: Bậc tự do; RSD: Độ lệch chuẩn). Mức độ phù hợp của mô hình được kiểm định thông qua các giá trị Q2, R2. Độ biến thiên thực R2 và độ biến thiên ảo Q2 cho ta biết một cách tổng quát sự thích hợp của mô hình thí nghiệm. R2 là tiêu chuẩn đánh giá cao nhất và Q2là tiêu chuẩn đánh giá thấp nhất. Cả hai giá trị này là các số dao động trong khoảng từ 0 đến 1 và Q2 đạt giá trị âm nếu mô hình không phù hợp, kết quả không đáng tin cậy.
Q2 và R2 đạt giá trị 1 chỉ ra mô hình rất tốt. Eriksson et al.,(2000) cho biết R2 dao động trong khoảng 0,8 – 0,9 và Q2 lớn hơn 0,5 là những giá trị chấp nhận được [39]. Điều này cũng tương đồng với các nghiên cứu của nhiều tác giả khác [40][38][42][44]
Giá trị R2 và Q2 trong thí nghiệm này lần lượt là 0,977 và 0,847 đều thõa mãn với điều kiện đã nêu trên. Kết quả này chứng tỏ mô hình tương thích với thực nghiệm.
Sau khi loại trừ hệ số không có ý nghĩa, chúng tôi xác định được phương trình hồi quy như sau:
Y = 273,954 + 52,3257 x1 - 36,8755 x2 -64,4044 x22 + 70,0907 x1 x2 (1)
Ảnh hưởng của mỗi biến số trong hàm hồi quy được thể hiện trong bảng 3.13 ở mức ý nghĩa 95%. Theo phương trình hồi quy (1) với hàm đáp ứng là hoạt tính protease thì nồng độ tween 80 và glucose đều ảnh hưởng đến hoạt tính protease. Nồng độ glucose ảnh hưởng đến hoạt tính protease theo hàm bậc một. Nồng độ tween 80 ảnh hưởng đến hoạt tính protease theo hàm bậc hai.
Mặt khác sự hiện diện của hệ số tương hỗ x1 x2 trong phương trình chứng tỏ nồng độ glucose và tween 80 không tác động độc lập mà tương tác giữa hai yếu tố này cũng ảnh hưỡng rõ rệt đến hoạt tính protease. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trước đó. Theo Rowe (1987), Keshavarzi và cộng sự (2005), môi trường gồm nhiều
81
thành phần dinh dưỡng thường được sử dụng trong nuôi cấy Bacillus, các thành phần trong môi trường tác động tương hỗ, ảnh hưởng đến hoạt tính protease [48][49].
Trong thí nghiệm này, phương trình hồi quy (1) tương thích với kết quả đó. Do vậy nếu ta chỉ xét ảnh hưởng của nồng độ glucose và tween 80 một cách rời rạc rồi kết luận nồng độ thích hợp nhất thì kết quả này sẽ không đáng tin cậy.
Phương trình hồi quy (1) được biểu diễn dưới dạng đồ thị đáp ứng bề mặt ở hình 3.16 trên ba trục tọa độ không gian và biểu diễn dưới dạng đồ thị các đường cong ở hình 3.17.
Hình 3.16. Đồ thị đường cong biểu diễn mối quan hệ của x1(nồng độ Glucose), x2 (nồng độ Tween 80) và y (hoạt tính protease)
Hình 3.17. Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ của x1(nồng độ Glucose), x2
(nồng độ Tween 80) và y (hoạt tính protease)
Nhận xét: Đồ thị hình 3.16 và 3.17 cho thấy ảnh hưởng rõ của nồng độ glucose và tween 80 đến hoạt tính protease. Chúng tôi nhận thấy không phải nồng độ glucose và tween 80 càng cao thì hoạt tính protease càng cao. Amin và Doelle (1990), Arcas et al.,(1987) cho rằng nồng độ chất dinh dưỡng quá cao sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn [50][51].
82
Kết quả tối ưu đạt được theo phương trình hồi quy như sau: - Nồng độ glucose: 3,9%
- Nồng độ tween 80: 0,03%
- Hoạt tính protease dự đoán theo phương trình hồi quy là 318.96 U/g
Tiến hành kiểm tra thực nghiệm hoạt tính protease với nồng độ glucose và tween 80 thu được từ phương trình hồi quy. Kết quả đạt được như sau: Hoạt tính protease thu được là 315,26 U/g ứng với nồng độ glucose là 3,9% và nồng độ tween 80 là 0,03%
Sự khác biệt về hoạt tính protease giữa giá trị dự đoán theo phương trình hồi quy và giá trị thực nghiệm là 1,16%.
Như vậy giá trị thực nghiệm thu được là rất gần với giá trị tính toán từ phương trình hồi quy. Vậy mô hình dự đoán có tính chính xác cao
Kết quả thu được bằng thực nghiệm cho thấy sự thay đổi nồng độ glucose và tween 80 đã làm thay đổi có ý nghĩa hoạt tính protease. Nồng độ glucose 3,9% và tween 80 là 0,03% được xem là các thông số tối ưu để thu được giá trị hoạt tính protease cực đại.
Kết quả thí nghiệm cũng phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả.
Egwin et al., (2012)[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của Tween 80 (chất hoạt động bề mặt) đến lượng protease sinh ra khi cho vào môi trường nuôi cấy B.subtilis. Kết quả thấy rằng khi cho tween 80 đã tăng lượng protease lên 5 lần. Theo các tác giả thì việc lựa chọn chất hoạt động bề mặt thích hợp trong nuôi cấy B.subtilislà yêu cầu cần thiết để sản xuất tối ưu protease. Ting wei Ku et al., (2009) [55] và Cong Wang et al., (2009)[26] đã chỉ ra rằng nguồn carbon tốt nhất trong nuôi cấy B.subtilis là glucose. Nadeem et al.,(2008)[43] nghiên cứu sản xuất protease bằng chủng Bacillus licheniformis đã khẳng định nguồn carbon tốt nhất là glucose. Saurabi S. et al., (2007)[50] đã kiểm tra sự phát triển và sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis SBP 29 cũng chỉ ra rằng glucose là nguồn carbon tốt nhất.