4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi
3.2.1. Đặc điểm hình thái
Để nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh 2 mẫu N18 và N441, chúng tôi tiến hành cấy trên môi trường thạch đĩa (MT1) ở 37o
C. Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc. Làm tiêu bản nhuộm Gram theo phương pháp 2.3.5và nhuộm bào tử theo phương pháp 2.3.6. Kết quả được nêu trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của hai mẫu N18 và N441
Đặc điểm Đặc điểm hình thái mẫu N18 Đặc điểm hình thái mẫu N441
Hình thái KL
Bề mặt hơi nhăn, khô, màu hơi vàng, ở giữa có một núm nhỏ hình tròn có màu vàng nhạt hơn, mép hình răng cưa, lan trên bờ mặt thạch
Bề mặt nhăn, nhầy và có các gợn sóng, màu trắng đục, mép hơi nhăn và bám chặt vào bề mặt thạch
Hình thái TB
Hình que, ngắn, nhỏ, xếp đơn hoặc đôi, bắt màu tím chứng tỏ chủng này là VKG(+)
Hình que, mảnh, xếp đơn hoặc đôi, bắt màu tím chứng tỏ chủng này là VKG(+)
Hình thành nội BT Hình thành nội bào tử, phân bố chính tâm
Hình thành nội bào tử, phân bố chính tâm
Hình dạng tế bào và bào tử đã được xử lý bằng cách cố định tế bào bằng 0,25% glutaraldehyde trong dung dịch đệm phosphate pH=7,2 và khử nước bằng ethanol ở các nồng độ đậm đặc tăng dần từ 30% đến 100%. Mẫu vi khuẩn chụp bằng kính hiển vi điện tử
67
quét SEM do Viện công nghệ Hóa học, Viện hàn lâm khoa học Việt nam thực hiện. Tế bào hình que, ngắn, điển hình của B.subtilis, bào tử thấy rõ phần trung tâm, còn các phần vỏ bị biến đổi nhiều (các hình 3.8; 3.9).
Hình 3.7. Hình thái KL của hai Mẫu N18 và N441
Hình 3.8. Hình thái TB của hai Mẫu N18 và N441 chụp SEM
Hình 3.9. Bào tử của hai Mẫu N18 và N441 chụp SEM
Mẫu N18 Mẫu N441
Mẫu N18 Mẫu N441
68
3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái
Các kết quả thu nhận được khi nghiên cứu các đặc điểm sinh học của 2 mẫu N18 và N441 được trình bày tóm tắt ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tóm tắt một số đặc điểm sinh học của mẫu N18 và mẫu N441
Đặc điểm sinh học Mẫu N18 Mẫu N441
Gram (+) + +
Hình thành nội bào tử + +
Nhu cầu về oxy + +
Catalase + +
Ghi chú: +: Kết quả dương tính - : Kết quả âm tính
Theo khóa phân loại của Bergey (2004) và các kết quả khảo sát đặc tính sinh học của 2 mẫu khảo sát được trình bày ở bảng 3.3 và bảng 3.4, cho phép chúng tôi kết luận như sau: Mẫu N18 và mẫu N441đều thuộc chi Bacillus.
3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử
Chúng tôi gửi hai mẫu N18 và N441 đến công ty xét nghiệm Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, P. Tân Hưng, Q.7, Tp. HCM) để định danh bằng cách giải trình tự gen 16S-rARN và so sánh với ngân hàng gen. Kết quả trình tự gen 16S rRNA của hai chủng như sau: - Chủng N441 ATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCG GACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT GGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG GATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAG GCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGA AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC TCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC - Chủng N18
69 TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACA GATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT AACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATG GTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACA GATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAA CGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGT TGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTAC CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG
So sánh với trình tự 16S-rARN của loài VK đã được định danh trong ngân hàng gen BLAST SEARCH. Kết quả cho thấy mức độ giống nhau của hai mẫuN18 và N441 với loài
B. subtilis là 100%. Kết quả này cho phép kết luận mẫuN18 và N441 đã phân lập được là B.
subtilis và chúng tôi gọi hai chủng này là B.subtilis N18 và B. subtilis N441.
B. subtilis là một loài rất phổ biến trong tự nhiên như đất, rơm, cỏ, được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều nghành khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất enzyme do có thể tạo ra được nhiều loại enyme như amylase, protease, lypase, cellulase, xylanase... Trong đó protease kiềm giàu nattokinase là nguồn enzyme quan trọng, có thể sử dụng làm thực phẩm chức năng chữa bệnh huyết khối cho con người.
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease
của chủng B. subtilis N18
3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành
Để tìm nồng độ cơ chất thích hợp cho B.subtilis N18. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng B.subtilis N18 trên MT3 đồng thời thay đổi tỉ lệ cám mì và bột đậu nành. Kết quả được trình bầy trong bảng 3.5 và hình 3.10
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18.
TN Cám mì (%) Bột đậu nành (%) Hoạt tính Protease (U/g) 1 0 100 33,54h ± 0,37 2 30 70 52,47e ± 0,43 3 40 60 62,69d ± 0,76 4 50 50 78,06c ± 0,99
70 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 0/10 3/7 4/6 5/5 6/4 7/3 10/0 Tỷ lệ cám mì/ bột đậu nành H oạt tí nh pr ot eas e (U /g) 5 60 40 94,61b ± 0,57 6 70 30 149,67a ± 0,75 7 100 0 46,01g ± 0,22
* Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05)
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
Nhận xét: Dựa vào kết quả TN bảng 3.5 và hình 3.10 cho thấy: Môi trường chỉ mình bột đậu nành và các muối cho hoạt tính enzyme thấp nhất (33,54 U/g). Điều đó có thể giải thích vì bột đậu nành mặc dù có nhiều chất dinh dưỡng như Protein (40%), lipid (12- 25%), glucid (10-15%), các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F, cellulose và có đủ các acid amin cơ bản như isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Các acid amin và các vitamin có tác dụng kích thích quá trình sinh tổng hợp enzyme protease. Nhưng môi trường không đảm bảo độ xốp, thiếu oxy để vi khuẩn phát triển. Tỷ lệ nồng độ cám mì/ bột đậu nành là 7/3 cho hoạt tính enzyme cao nhất (149,67 U/g). Cám mì cũng chứa rất nhiều dinh dưỡng như chất xơ, khoáng chất và các loại acid amin. Thành phần dinh dưỡng biến động xung quanh 87% vật chất khô, 16,5% protein thô, 4% béo thô, 10% xơ thô, 42% NDF, 16% ADF, 0,6% lysin, 0,27% methionin, 5,3% tro, 0,15% canxi, 1,8% phosphor tổng số. Trong quá trình phát triển, B.subtilis sử dụng các chất dinh dưỡng có trong cám mì và bột đậu nành, hơn nữa B.subtilis là loài hiếu khí tùy ý, nhưng trong điều kiện thoáng khí hoạt động mạnh hơn. Vì vậy bột đậu nành được xay nhỏ kết hợp với cám mì tạo độ thoáng khí vừa phải, giúp B.subtilis sinh trưởng tốt, sử dụng chất dinh dưỡng được tối đa, kích thích sản sinh nhiều enzyme. Số lượng cám
71
mì/ bột đậu nành ở các tỉ lệ 5/5; 6/4 cũng cho hoạt tính enzyme cao tương ứng là 78,06 và 94,61 U/g, tuy nhiên theo phân tích thống kê cho thấy nó vẫn thấp hơn so với tỉ lệ cám mì/ bột đậu nành 7/3(149,67 U/g), nên chúng tôi chọn tỉ lệ cám mì/ bột đậu nành là 7/3 cho các khảo sát nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả.
Chen Tiên Chang et al.,(2000)[25], tác giả cũng đã sử dụng B.subtilis IMR-NK1 để sản xuất enzyme thủy phân fibrin bằng phương pháp lên men bán rắn với cám lúa mì.
Dong Ming Jiang et al., (2001)[28] sử dụng bột đậu nành 2%, cám mì 0,5% làm cơ chất sinh tổng hợp protease ở chủng B.subtilis NK5
Saurabh S. et al., (2007)[46] cho rằng nguồn carbon tốt nhất là cám mì và nguồn nitrogen tốt nhất là bột đậu nành.
Nadeem et al.,(2008)[43] và Ting wei Ku et al., (2009)[55] sử dụng môi trường có bột đậu nành để nghiên cứu sản xuất protease từ chủng Bacillus licheniformis và B.subtilis
natto.
Cong Wang et al., (2009)[26], nghiên cứu thấy rằng nguồn nitơ tốt nhất để nuôi cấy chủng B.subtilisB12 là cám lúa mì, tiếp đến là bột đậu nành.
3.4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường
Khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường bán rắn, độ ẩm môi trường có vai trò hết sức quan trọng, nếu độ ẩm thấp quá sẽ không đủ nước để vi sinh vật phát triển, còn khi độ ẩm quá lớn sẽ giảm độ xốp, ảnh hưởng tới quá trình trao đổi vật chất giữa thể rắn và thể khí. Trong môi trường nuôi B.subtilis trên hai cơ chất cám mì và bột đậu nành, kích thước các hạt đều nhỏ, chủng B.subtilis lại sinh nhiều chất keo (γ- polyglutamic acid), làm môi trường khó thoát nước làm khô, vì vậy không thể đưa độ ẩm lên 70% được, kết quả thí nghiệm của chúng tôi cho thấy độ ẩm từ 50 đến 60% đều cho hoạt tính cao (hình 3.11 và bảng 3.6).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
TN Độ ẩm (%) Hoạt tính Protease (U/g) 1 40 149.24c ± 0,94 2 50 176.34b ± 1,55 3 60 178.06a ± 0,37
72 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 40 50 60 70 80 H oạ t tính pr ote ase (U /g) Độ ẩm môi trường (%) 4 70 112.90d ± 0,00 5 80 56.56e ± 0,57
* Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05)
Hình 3.11. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
3.4.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men
Nấm men là nguồn cung cấp vitamin nhóm B cho vi sinh vật phát triển. Sử dụng nấm men với một nồng độ thích hợp sẽ kích thích tăng trưởng cũng như khả năng tổng hợp protease của VSV. Vì vậy chúng tôi nuôi B. subtilis N18 trên môi trường có tỷ lệ cám mì/ bột đậu nành là 7/3, độ ẩm 60%, đồng thời bổ sung nấm men với các nồng độ 0,1%; 0,2% và 0,3%. Kết quả được trình bầy trong bảng 3.7 và hình 3.12.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ nấm men đến khả năng tổng hợp protease của chủng B. subtilis N18 STT Nồng độ nấm men (%) Hoạt tính protease (U/g) 1 Đối chứng 189,02b ± 0,37
73 0 50 100 150 200 250 Đối chứng 0,1 0,2 0,3 Ho ạt tính pr ot ea se (U /g ) Nồng độ nấm men trích ly (%) 2 0,1 194,18a ± 0,00 3 0,2 195,26a ± 0,57 4 0,3 122,36c ± 0,57
* Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau
không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05)
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ nấm men trích ly đến khả năng tổng hợp protease của chủng B. subtilis N18
Nhận xét: Qua kết quả được trình bầy ở bảng 3.7 và hình 3.12 cho thấy khi bổ sung nấm men vào MT nuôi cấy với nồng độ 0,2% cho hoạt tính protease cao nhất (195,26 U/g). Tuy nhiên khi tăng lên nồng độ 0,3% thì hoạt tính protease giảm còn 122,36 U/g. Điều đó có thể giải thích do chất dinh dưỡng được bổ sung quá nhiều làm thay đổi MT nuôi cấy dẫn đến ức chế khả năng sinh tổng hợp enzyme protease.
Nghiên cứu cho thấy nồng độ nấm men tối ưu là 0,2%. Hơn nữa theo phân tích thống kê thì sự chênh lệch hoạt tính protease tại nồng độ 0,1% (194,18 U/g) và 0,2% (195,26 U/g ) không có ý nghĩa. Nên chúng tôi quyết định chọn nồng độ nấm men bổ sung vào MT nuôi cấy là 0,1% cho các khảo sát tiếp theo.
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
pH môi trường tác động trực tiếp lên VSV, ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV. Do đó pH là một trong những yếu tố quan trọng cần được nghiên cứu. TN nhằm xác định pH tối ưu giúp VSV tổng hợp enzyme protease có hoạt tính
74 0 50 100 150 200 250 5 6 7 8 9 10 11 12 pH môi trường H oạt tí nh pt ot eas e (U /g)
cao nhất. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng B.subtilis N18 trên MT tối ưu theo mục 3.3.3 với các pH khác nhau. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8 và hình 3.13.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
STT pH Hoạt tính protease (U/g)
1 6 137,62d ± 0,22 2 7 190,31c ± 0,37 3 8 220,85b ± 0,94 4 9 230,31a ± 0,75 5 10 192,03c ± 0,86 6 11 72,68e ± 0,22 7 12 33,76g ± 0,22
* Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác
nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05)
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
Nhận xét: Kết qủa trình bầy ở bảng 3.8 và hình 3.13 cho thấy trị số pH đầu tiên của MT có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18. Với pH ban đầu là
75
6,0 thì hoạt tính protease thấp 137,62 U/g. Tại pH 11 và 12 thì hoạt tính protease cũng giảm mạnh, tương ứng là 72,68 U/g và 33,76 U/g. Hoạt tính enzyme có sự thay đổi như vậy có thể giải thích là khi pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ức chế quá trình trao đổi chất do ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của VSV, chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men, dẫn đến ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hoạt hóa enzyme. pH ban đầu thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như tổng hợp protease của chủng B.subtilisN18 từ 8,0 – 10,0 và tối ưu ở pH 9 (đạt 230,31 U/g). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của các tác giả khác. Saurabh S. et al., (2007)[50] đã kiểm tra sự phát triển và sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis SBP 29. Hoạt tính tối đa protease đạt được trên MT có pH tối ưu là 9,5. Chang Jin Liu et al., (2004) [24] đã tối ưu hóa quá trình lên men sản xuất nattokinase ở chủng B.subtilis SBS (J). Điều kiện lên men tối ưu ở pH ban đầu 8,3. Nadeem et al.,(2008)[43] đã nghiên cứu sản xuất protease bằng chủng Bacillus licheniformis ưa kiềm trong môi trường tối ưu có pH 10. Nurullah et al.,(2011) [44] đã nghiên cứu sản xuất protease kiềm từ chủng B.subtilis RSKK96 bằng phương pháp lên men bán rắn. Hoạt tính enzyme đạt được cao nhất trên môi trường pH ban đầu 9.
3.4.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống
Tỷ lệ giống cấy có ảnh hưởng quan trọng đển chất lượng và thời gian lên men. Trong thí nghiệm này chúng tôi thực hiện trên môi trường có tỷ lệ cám mì/bột đậu nành theo tỷ lệ 7/3, pH trước khi thanh trùng bằng 9, nhiệt độ nuôi 37oC, chủng VK B.subtilis N18. Kết quả trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.14
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
Nghiệm thức Hoạt tính protease (U/g) 107 108
ĐC 203,00 ± 0,22 206,44 ±0,75 NaC l0,5% 123,00 ± 0,22 194,18 ± 0,00
76 0 50 100 150 200 250 300 Đc NaCl, 0,5% NaCl, 0,5%+ YE 0,1% Thành phần môi trường H oạt t ính pr ot eas e (U /g) 1.00E+07 1.00E+08
Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
Nhận xét: Qua kết quả bảng 3.9 và hình 3.14, chúng tôi nhận thấy trong MT có bổ sung thêm 0,5% NaCl thì hoạt tính enzyme giảm ở cả hai trường hợp với lượng giống 107 cfu/g cũng như lượng giống 108 cfu/g môi trường, Nhưng khi có bổ sung thêm NaCl 0,5% + 0,1% nấm men trích ly và tỉ lệ cấy giống là 108 cfu/g thì hoạt tính enzyme tăng so với đối chứng ở cả hai mật độ giống. Vì vậy chúng tôi chọn MT có bổ sung thêm NaCl 0,5% + 0,1% nấm men trích ly và tỉ lệ cấy giống là 108cfu/g cho các khảo sát tiếp theo.
3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+
và K+
Ngoài các yếu tố như Magnesium, calcium, thì kẽm và kali cũng là những nguyên tố cần thiết cho sư tổng hợp Nattokinase. Xue Jian et al., (2005)[59] đã chỉ ra rằng MgSO4 0,2%, CaCl2 0,2% cho hoạt tính protease cao nhất. Trên môi trường cơ sở có magnesium và