4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.4.Giới thiệu bệnh huyết khối
1.4.1. Khái niệm về huyết khối
Bình thường, trong cơ thể, máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái thể dịch nhờ sự cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá và ức chế đông máu. Khi xảy ra tổn thương mạch máu, các yếu tố đông máu sẽ cùng với nội mạc mạch máu và tiểu cầu phối hợp xảy ra một loạt các phản ứng để tạo nút cầm máu tại vị trí tổn thương. Tình trạng tăng đông máu xảy ra khi mất cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá và ức chế đông máu do tăng hoạt hoá đông máu hoặc do giảm ức chế đông máu, tiêu sợi huyết dẫn đến huyết khối lan rộng quá giới hạn cần thiết, gây tắc nghẽn. Huyết khối có thể được định nghĩa là một quá trình bệnh lý do một sự phát động và lan rộng bất hợp lý của phản ứng cầm máu của cơ thể dẫn đến hình thành huyết khối trong lòng mạch máu. Tuỳ theo kích thước của huyết khối, đường kính mạch máu mà huyết khối có thể gây tắc mạch hoàn toàn hay bán tắc, nghẽn mạch….[20]
1.4.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối
Huyết khối được tạo thành do 3 nguyên nhân:
- Tổn thương mạch máu: Khi mạch máu bị tổn thương do áp lực máu cao, những thứ
có trong mạch máu như cholesterol, tiểu cầu đến tích tụ ở những nơi bị tổn thương khiến mạch máu trở nên cứng và dày lên, lòng mạch máu dần dần hẹp lại.
- Xơ vữa động mạch (XVĐM): Chất béo tích tụ trong thành của các động mạch tạo
thành các mảng XVĐM. Mảng XVĐM có thể ngày càng to dần gây hẹp lòng của động mạch. Đôi khi mảng XVĐM bị vỡ ra làm cho máu tiếp xúc với lõi chất béo bên trong mảng. Khi đó các tế bào tiểu cầu và hệ thống đông máu bị hoạt hóa dẫn đến hình thành huyết khối gây tắc động mạch.
35
- Giảm sản sinh, giảm hoạt tính Plasmin:Plasmin là enzym duy nhất trong cơ thể có
khả năng làm tan huyết khối. Khi giảm sản sinh và giảm hoạt tính plasmin, huyết khối sẽ dễ dàng hình thành và không bị loại bỏ [20]
1.4.3. Biến chứng của bệnh huyết khối
Huyết khối xuất hiện khi dải protein có tên là fibrin tích lũy trong lòng mạch. Ở tim, huyết khối là nguyên nhân gây tắc các dòng mạch máu tới nuôi mô và cơ tim. Nếu dòng máu bị chặn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm hoặc không còn. Điều này dẫn đến chứng đau thắt ngực và cơn đau tim. Huyết khối trong các tâm thất của tim có thể di chuyển lên não. Trong não, huyết khối có thể gây tắc nghẽn các mạch máu lên não và gây ra các biến chứng: Tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ. Một số biến chứng thường gặp do ảnh hưởng của huyết khối:
Bệnh động mạch vành:Bệnh này ảnh hưởng đến các mạch máu cung cấp máu cho
cơ tim. Nếu động mạch bị nghẽn và dòng máu đưa vào tim bị hạn chế, có thể gây ra cơn đau tim đột qụy, bệnh động mạch vành cũng có thể gây ra cơn đau ngực. Đột quỵ: Đột quỵ khi động mạch mang máu và oxy đến tim bị chặn lại, không có oxy, phần cơ này của tim không hoạt động và sẽ có cảm giác đau ở ngực. Trong giai đoạn cấp, bệnh nhân yếu đột ngột hoặc liệt hẳn một nửa bên người kèm với yếu hoặc liệt nửa mặt cùng bên. Người bệnh có thể có những triệu chứng khác như: Nói khó, nuốt khó, rối loạn thị giác, mất thăng bằng. Nặng hơn là rối loạn tri giác, lơ mơ hoặc hôn mê, thậm chí có thể ngưng thở và tử vong rất nhanh.
Suy tim:Tim khoẻ mạnh sẽ bơm máu đến khắp cơ thể. Một quả tim yếu sẽ không đủ
khả năng làm việc bơm máu này một cách hiệu quả. Khi tim không bơm đủ máu, sẽ bị suy tim.
Xơ vữa động mạch: Khi các mạch máu bị tắc bởi sự tích tụ cholesterol, chất béo và
canxi (còn được biết đến như là những mảng bám), đây chính là điều kiện dẫn đến bệnh XVĐM. Những mảng bám tạo thành trên thành của mạch máu, mạch máu trở nên kém mềm dẻo và sự lưu thông trong mạch máu cũng kém hơn, làm dòng máu khó chảy qua. Đột quỵ hay cơn đau tim có thể xuất hiện nếu sự tích tụ mảng bám trở nên dày và mạch máu bị tắc nghẽn nên dòng máu không thể chảy qua được.
Huyết áp cao: Huyết áp cao xuất hiện khi máu được đẩy đi trong mạch máu với áp
suất cao. Khi huyết áp lên cao, thành mạch trở nên yếu và có thể gây ra các biến chứng như đột quỵ hay cơn đau tim.
36
Những enzyme làm tan huyết khối được sinh ra ở thành tế bào trong lòng mạch máu có ở khắp cơ thể như: Trong động mạch, hệ thống mao mạch và mạch bạch huyết. Ở người già việc sản sinh các enzym này bị suy giảm dẫn đến tình trạng hình thành các huyết khối ở bất kỳ vị trí nào trong cơ thể. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự tắc nghẽn dòng máu lên não có thể gây suy giảm và mất trí nhớ ở người cao tuổi [20].
Hình 1.10. Biến chứng của bệnh huyết khối
1.4.4. Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam
Hàng năm trên thế giới có khoảng 17 triệu người tử vong vì nhồi máu cơ tim và 5 triệu người tử vong vì đột quỵ. Đây là hai trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay và đều xuất phát từ một nguyên nhân, đó là hậu quả của chứng huyết khối do XVĐM. Theo dự báo của WHO thì huyết khối sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào năm 2020. Nhồi máu cơ tim thường xảy ra đột ngột, nhanh và rất nguy hiểm. Khoảng 30% bệnh nhân chết trước khi kịp đến bệnh viện [57].
Trong số những người nhập viện, có 5 đến 10% chết do các biến chứng như suy tim, choáng tim, rối loạn nhịp tim. Theo thống kê cứ 6 người bị nhồi máu cơ tim thì có 1 người sẽ bị tái phát cơn nhồi máu cơ tim, đột quỵ, tử vong do tim mạch sau 1 năm.
Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán đột quỵ. Trong những năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh huyết khối ngày càng tăng cao và ngày càng có nhiều người trẻ tuổi bị huyết khối [57].
37
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.1. Nguyên vật liệu
- Chế phẩm natto của Nhật Bản bán tại Việt Nam.
- Nguyên liệu làm cơ chất: Bột đậu nành, cám gạo, cám lúa mì.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
2.1.2.1. Dụng cụ
Que cấy vòng, que cấy nhọn, bình tam giác, ống nghiệm, bình định mức, pipetman, ống đong, ống ly tâm, eppendorf , đèn cồn, diêm quẹt, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc, khăn lọc, bông mỡ, bông thấm nước, lame, lamel…
2.1.2.2. Thiết bị
Các loại máy móc: Tủ ấm (Sanyo, Nhật), nồi hấp vô trùng (ALP, Nhật), tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ sấy (Memmert, Đức), máy lắc (Gerhardt, Đức), máy li tâm (Hettich, Đức), tủ lạnh (National, Nhật), cân phân tích điện tử (Sartorius, Đức), máy đo quang phổ UV(Amersham Biosciences, Thụy Điển), kính hiển vi (Olympus, Nhật), máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus, Nhật), máy đo pH (Windaus, Mỹ), tủ ấm (Sanyo, Nhật), máy trưng cất đạm (Gerhardt, Đức), tủ giữ giống (Sanyo, Nhật)
2.1.3. Hóa chất
- Glucose, cao thịt, cao nấm men, peptone, bột đậu nành, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl, Na2CO3, Na2HPO4, CuSO4.5H2O, MnSO4, MnCl2, CaCl2, ZnSO4.7H2O, Casein, Albumin, Tyrosin, Fibrin, NaOH, HCl, Agar...
- Thuốc nhuộm: Tím gelatin, lugol, xanh metylen, đỏ trung tính, fuchsin, phenolphtalein....
2.2. Môi trường nghiên cứu
MT1: MT phân lập, giữ giống, nhân giống VK
Nước chiết đậu nành 200ml, Glucose 15g, Pepton 10g, Yeast extract 5g, K2HPO4 2g, KH2PO4 3g, dung dịch A 5ml, dung dịch B 5ml, dung dịch C 5ml, agar 20g, Nước 1000ml, pH 7,5 trước thanh trùng.
Nước chiết đậu nành: 100g đậu nành ngâm 12 – 14 giờ, rửa sạch, cho 150ml nước
luộc chín, thanh trùng 1 atm trong 30 phút, nghiền mịn, lọc lấy nước, bổ sung nước cho đủ 200ml.
38 Dung dịch A Dung dịch B Thành phần Nồng độ FeSO4.7H2O 2g/l H2SO4đđ 3ml/l Nước cất 1 lít
Hòa tan 2g FeSO4.7H2O vào 100ml nước cất. Sau đó cho 3ml dung dịch H2SO4 đđ vào. Sau khi tan hết thì bổ sung nước cất cho đủ 1 lít.
Dung dịch C: Hòa 20g CaCl2vào 1 lít nước cất.
MT2: Môi trường thử hoạt tính catalase
Thành phần Nồng độ Pepton 5g/l Cao thịt 5g/l Yeast extract 5g/l Glucose 10g/l MnSO4. 4H2O 0,1g/l Tween 80 0,5g/l Agar 18g/l Nước cất 1 lít
MT3: Môi trường bán rắn sản xuất enzyme protease
Cám lúa mì 50g, Bột đậu nành 50g, dung dịch A 5ml,dung dịch B 5ml, dung dịch C 5ml, pH ban đầu 7,5, độ ẩm 60%.
MT4: Môi trường thử hoạt tính enzyme protease
Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ MgSO4.7H2O 12,3 g/l MnSO4.4H2O 0,223g/l ZnSO4.7H20 1,4g/l Nước cất 1 lít
39 Casein 5g/l NaHCO3 2g/l Agar 15g/l pH 7,5 H2O 1 lít
40
SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM TỔNG QUÁT
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Nguyên tắc [14]
- Tách rời các tế bào vi khuẩn Chế phẩm natto của Nhật Bản
Chủng Bacillusđược chọn
Thử nghiệm catalase Định danh bằng sinh học phân tử Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy( độ ẩm, thời gian, pH, tỉ lệ giống…) đến hoạt tính protease. Phân lập chọn chủng Bacillus Sấy khô Nghiền Lên men Nhân giống Giữ giống Thành phần MT( bột đậu nành, cám mì, muối khoáng…) Hoạt tính enzyme VSV lạ (E.coli, Salmonella) Tiêu chuẩn hóa chất lượng
Nhuộm Gram
41
- Nuôi cấy các tế bào trong MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, tách biệt nhau.
* Cách tiến hành
- Lấy 10g natto của Nhật Bản giã nhỏ trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác có 90ml nước muối sinh lý, lắc đều tạo huyền phù, được dung dịch pha loãng 10-1.
- Lắc đều, hút 1 ml dung dịch 10-1cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý, ta được dịch pha loãng 10-2. Cứ tiếp tục pha loãng như thế được dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 , 10-8
- Từ dịch pha loãng 10-7, 10-8, nhỏ 0,1 ml (ở mỗi nồng độ) vào đĩa petri có sẵn MT1. Dùng que trang trải đều dung dịch khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que trang đó trải tiếp 2 đĩa tiếp theo (mỗi nồng độ 3 đĩa).
- Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h – 48h. Chọn những KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng[10].
* Phương pháp làm thuần [13]
- Lấy 1 KL riêng rẽ trên ống thạch nghiêng hòa vào nước cất vô trùng, trải lên đĩa lần 2. Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới KHV đều có 1 dạng tế bào, chứng tỏ giống phân lập đã thuần khiết.
- Sau đó chọn các KL riêng rẽ cấy chuyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa.
* Yêu cầu:Chủng phân lập được phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết [4].
2.3.2. Phương pháp cấy truyền VSV
- Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa MT1 đã vô trùng. Dùng que cấy vô trùng, cấy zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Để ống nghiệm ở 370C, sau 24h – 48h thấy xuất hiện KL thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40
C giữ giống.
- Giống được cấy chuyền hàng tháng và hoạt hóa trước khi nhân giống [10].
2.3.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng
- Yêu cầu của PP này là sử dụng dầu khoáng như parafin lỏng hay vazơlin phải trung tính, có độ nhớt cao, không chứa các sản phẩm độc với VSV và vô trùng.
* Nguyên tắc:
Bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống bằng cách tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng của VSV
42
* Cách tiến hành: [10][14][17]
- Khử trùng dầu khoáng bằng cách hấp ở 1210C trong 30 phút. Sau sấy khô ở tủ sấy (1700C) trong 1 – 2 giờ.
- Để nguội.
- Đổ lên bề mặt MT có VSV phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm.
- Dùng keo parafin đặc quấn quanh miệng và giữ ở điều kiện lạnh 4 – 60C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc
* Nguyên tắc
Quan sát, mô tả hình dạng, kích thước và màu sắc KL của các chủng phân lập được để xác định hình dạng tế bào, khả năng di động và khả năng bắt màu qua phương pháp nhuộm Gram.
* Tiến Hành [13].
- Lấy một vòng que cấy KL trên ống thạch nghiêng, gạt 3-4 lần trên mặt thạch (MT1) ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3 - 4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước. Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần VK dính trên que cấy. Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy.
- Đặt mẫu ở nhiệt độ 370
C trong 1-2 ngày để chọn ra các KL mọc riêng rẽ.
- Tiến hành quan sát các KL này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng KL, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc ( trên, dưới, có khuếch tán ra MT không).
2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram
* Nguyên tắc [14]
- Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương.
- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm.
* Cách tiến hành [13]
43
- Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.
- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút. - Nhuộm lugol trong 1 phút.
- Rửa bằng nước cất.
- Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến khi tan hết màu.
- Rửa bằng nước cất.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây.
- Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100
* Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dương sẽ bắt màu tím. Chọn các chủng VK Gram dương để tiếp tục nghiên cứu.
2.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A. Peskop
* Nguyên tắc [13]
- Dựa vào cấu trúc đặc biệt của bào tử: Dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lí để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit.
- Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và TB bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. - Tẩy màu tế bào chất TB đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất TB bắt màu phân biệt.
* Cách tiến hành
- Làm vết bôi với VK nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống thạch nghiêng và để vết bôi khô tự nhiên.
- Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhuộm xanh metylen, hơ nóng phía dưới và giữ trong 1 phút (nếu thuốc cạn phải bổ sung ngay).
- Rửa kĩ vết bôi cho đến khi hết màu. - Nhuộm đỏ trung tính 0,5% trong 1 phút.
- Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100.
* Đọc kết quả: Bào tử màu xanh, tế bào chất màu đỏ.
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase
44
- VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các chủng Streptococcus spp). Enzyme này thủy phân hydrogen perioxide (H2O2) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen perioxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện