4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao
Để đánh giá sơ bộ khả năng sinh protease của các mẫu phân lập được, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.12, từng mẫu tách được chúng tôi cấy trang trên MT1, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ, đục thỏi môi trường có VK phát triển tốt và đặt lên MT4, ủ tiếp 24h ở 370C. Nhỏ dung dịch TCA 0,4M lên trên mặt thạch MT4. Nếu thấy xung quanh thỏi thạch xuất hiện vòng trong suốt thì chứng tỏ VK đó có khả năng sinh protease, vì chính protease đã phân giải cơ chất casein trong MT4 làm cho môi trường trở nên trong suốt. Kết quả trình bày ở hình 3.4
62
Hình 3.4. Vòng phân giải casein của một số VK phân lập được bằng phương pháp đặt thỏi thạch
Từ kết quả hình 3.4 cho thấy tất cả các mẫu phân lập được đều có khả năng sinh protease, tuy nhiên có một số mẫu có hoạt tính yếu (12/20 mẫu). Trong số các mẫu có hoạt tính protease, chúng tôi chọn được 8 mẫu có hoạt tính cao (có đường kính lớn hơn 2 để tiếp tục nghiên cứu). Các mẫu sau đây đã được chọn lọc gồm: N17, N18, N21 N23 N24, N32, N441, N36 và hai chủng BC và 8.1 (trong bộ sưu tập của phòng thí nghiêm). Tiếp theo tiến hành kiểm tra khả năng sinh protease của các mẫu bằng cách đo đường kính vòng thủy phân casein của các mẫu theo phương pháp 2.3.12. Qua độ lớn của đường kính vòng thủy phân có thể đánh giá khả năng sinh protease của các mẫu. Kết quả được trình bầy ở bảng 3.1 và hình 3.5. N18 N23 BC 8.1 N441 N17 N24 N32 N46 N420 N43 N30 N36 N21 N32 N26 N13
63
Hình 3.5. Vòng phân giải casein của 10 mẫu VK có hoạt tính protease cao nhất
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của 10 mẫu VK có hoạt tính protease cao nhất
STT Ký hiệu mẫu Hoạt tính protease (D - d) (cm)
N18 8.1 BC
N21 N17 N32
N24 N23 N441
64 1 8.1 2,6 ± 0,1 2 BC 2,5 ± 0,03 3 N18 2,6 ± 0,04 4 N17 2,4 ± 0,15 5 N441 2,4 ± 0,06 6 N36 2,1 ± 0,02 7 N21 2,1 ± 0,15 8 N23 2,3 ± 0,09 9 N24 2,2 ± 0,11 10 N32 2,1 ± 0,04
Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của các mẫu VK đã tuyển chọn, chúng tôi tiến hành nuôi các mẫu phân lập được gồm: N18, N17, N441, N36, N21, N23, N24, N32, 8.1, BC trong MT3 tại 4 mốc thời gian là 24 giờ, 40 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, thu dịch enzyme thô và xác định hoạt tính protease của các mẫu theo phương pháp Anson cải tiến (mục 2.3.13). Kết quả được trình bầy tại bảng 3.2 và hình 3.6.
Bảng 3.2. Hoạt tính protease của 10 mẫu VK đã tuyển chọn
STT Kí hiệu Hoạt tính protease (U/g)
24 giờ 40 giờ 48 giờ 72 giờ
1 N24 26,67 ± 0,43 42,58±0,37 44,73±0,22 40,86±0,78 2 N17 41,93 ± 0,37 44,94±0,57 63,87±0,00 42,79±0,57 3 BC 71,61 ± 0,37 79,35±0,65 97,42±0,37 73,55±0,99 4 N21 16,77 ± 1,34 18,71±0,37 39,35±0,37 23,23±0,00 5 N32 17,85 ± 0,94 21,29±0,65 35,70±0,94 23,87±0,37 6 8.1 67,31 ± 0,22 75,91±0,22 97,85±0,57 53,76±1,14 7 N23 18,92 ± 0,94 33,12±0,57 42,36±0,57 17,63±0,57 8 N18 54,62 ± 0,86 94,62±0,57 110,53±1,20 58,92±0,22
65 0 20 40 60 80 100 120 N24 N17 BC N21 N32 8.1 N23 N18 N441 N36 H oạt tí nh pr ot eas e (U /g)
24 giờ 40 giờ 48 giờ 72 giờ
9 N441 50,32 ± 1,34 80,97±0,37 92,14±0,57 53,12±0,78 10 N36 27,10 ± 0,00 36,99±0,78 48,82±0,94 28,60±0,22
Hình 3.6. Hoạt tính protease của 10 mẫu VK đã tuyển chọn
Nhận xét: Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 cho thấy đa số các mẫu nghiên cứu sinh tổng hợp protease cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy với hoạt tính cực đại là 110,53 U/g (ở mẫu N18). Vào thời điểm này VSV đang ở kỳ đầu của pha tích tụ sản phẩm trao đổi chất, lượng enzyme sinh ra là cao nhất. Trước thời điểm trên thì VSV ở thời kì sinh trưởng, chủ yếu tổng hợp protein và xây dựng tế bào nên tích tụ sản phẩm trao đổi chất rất ít. Sau 48 giờ trở đi thì lượng enzyme giảm đáng kể do tế bào bắt đầu tự phân và một số sản phẩm trao đổi chất trở thành nguồn dinh dưỡng cho VSV.
Tùy theo hình thức lên men dịch thể hay lên men bán rắn mà thời điểm đạt đựợc hoạt tính enzyme cao nhất sẽ khác nhau. Dong Ming sheng et al., (2001)[29] cho rằng chủng
Bacillus subtilis khi lên men dịch thể cho hoạt tính cao nhất sau 24 giờ. Chang Jin Liu et
al., (2004)[24] đã nghiên cứu sinh tổng hợp Nattokinase của chủng Bacillus subtilis SBS (J) đạt tối ưu tại 44 giờ. Saurabh S. et al., (2007)[50] đã kiểm tra sự phát triển và sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis SBP 29. Hoạt tính tối đa protease đạt được 3028 U/ml trên môi trường dịch thể có 1,5% bột đậu nành là sau 18 giờ lên men. Nadeem et al.,(2008) [43] đã nghiên cứu sản xuất protease bằng chủng Bacillus licheniformis thấy hoạt tính protease đạt cao nhất trong 12 giờ. Nurullah et al.,(2011)[44] đã nghiên cứu sản xuất
66
protease kiềm từ chủng Bacillus subtilis RSKK96, hoạt tính enzyme đạt được cao nhất tại thời gian nuôi 120 giờ. Essam et al.,(2012)[32] đã cho rằng khi lên men bán rắn, việc sinh tổng hợp nattokinase đạt tối ưu sau thời gian lên men 2 ngày.
Như vậy khi lên men các chủng Bacillus sp để sản xuất protease hoặc Nattokiane thì thời gian cho enzyme cao nhất trong lên men dịch thể sớm hơn so với lên men bán rắn.
Dựa trên kết quả thí nghiệm trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.6 cho thấy các mẫu vi khuẩn cho hoạt tính cao nhất là N18, tiếp đến là BC, 8.1 và N441. Tuy nhiên hai chủng 8.1 và BC do không phân lập từ các chế phẩm thực phẩm lên men truyền thống như natto Nhật Bản, vì vậy để an toàn hơn trong việc tạo ra chế phẩm cho con người có thể sử dụng, chúng tôi chọn mẫu N18 và N441 có hoạt tính cao để tiếp tục nghiên cứu.