4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry
Để xác định nồng độ protein trong dung dịch, có nhiều phương pháp khác nhau: Lowry, Biuret, BAC, Bradford, Hartree, lowry cải tiến, hấp thu UV( UV absortin). Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Ỏ đây chúng tôi sử dụng phương pháp Lowry [8]
* Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan, hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau.
Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu, màu này tỉ lệ với hàm lượng của tyrosin và tryptophan (hàm lượng protein). Vì vậy ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích với những mẫu chuẩn có nồng độ protein đã biết. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1µg/cm3
.
* Hóa chất sử dụng
Dung dịch Albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1g Albumin pha với nước cất thành 100ml
Dung dịch A: Cân 2g Na2CO3 hòa trong NaOH N/10 thành 100 ml
Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch Citrat Natri 1% thành 100ml
Dung dịch C: (chỉ pha dùng trong ngày) là hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1
Thuốc thử Folin
* Cách tiến hành
- Hút 0,4 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm sạch và sấy khô.
- Thêm vào 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Thêm vào 2ml thuốc thử Folin, lắc đều để trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 750 nm.
• Dựng đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là Albumin của bò đã đông khô. Từ dung dịch albumin chuẩn tiến hành pha loãng như sau:
50 Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ Albumin γ/ml 0 50 100 150 200 250 Dung dịch Albumin 0,1% 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Nước cất 5 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5
Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ protein chuẩn (γ/ml)
* Cách tính
Từ đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein, từ đó suy ra hàm lượng protein của dung dịch enzyme là a (γ/ml)
Lượng protein (M) có trong 1 ml dung dịch enzyme hay chế phẩm enzyme được tính theo công thức:
a x 10-3 x n m
Trong đó M: Lượng protein có trong 1ml dung dịch enzyme hay chế phẩm enzyme (mg protein/g chế phẩm enzyme hay mg protein/ml chế phẩm enzyme)
a : Hàm lượng protein (γ/ml dung dịch) n : Hệ số pha loãng
m : Khối lượng chế phẩm enzyme