4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.12.Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
* Nguyên tắc [6]
Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ thạch. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme.
* Cách tiến hành
• Phương pháp đặt thỏi thạch
- Chuẩn bị các chủng VK cần nghiên cứu và nuôi trên MT1 - Chuẩn bị MT thử hoat tính enzyme protease ( MT4)
47 lên MT4
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Sau đó đo đường kính vòng phân giải. Phương pháp này chỉ sơ bộ định tính enzyme.
• Phương pháp khoan lỗ thạch
- Chuẩn bị các đĩa petri có MT4
- Dùng khoan nút chai (đường kính d = 0,9 cm) khoan lỗ trên đĩa thạch.
- Lấy 5g môi trường rắn sau lên men, nghiền mịn trong cối sứ vô trùng, hòa trong 100ml nước muối sinh l í, lắc đều, lấy 1ml cho vào eppendorf ly tâm, lấy dịch trong.
- Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch enzyme thô vào lỗ thạch, đặt trong tủ ấm 370 C trong 24 giờ
- Kiểm tra hoạt tính protease: Thuốc thử là TCA. Nếu VK có sinh protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan, phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của casein với TCA
- Đánh giá khả năng sinh protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải D-d (cm). Trong đó D: Đường kính vòng phân giải (cm), d: Đường kính lỗ thạch (cm).
• D-d ≥ 2,5 cm: Rất mạnh. • D-d ≥ 2,0 cm: Mạnh. • D-d ≥ 1,5 cm: Trung bình. • D-d < 1,0 cm: Yếu.