X 4= (GM−G C)
h) Làm tròn và trình bày kết quả
Làm tròn kết quả tính theo biểu thức a.10n. a là số thập phân tương ứng.
i) Lưu ý
Trường hợp vi sinh vật mọc lan, tính mỗi vết loang là một khuẩn lạc. Nếu nồng độ pha loãng cao nhất có số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa >200, vd: ở nồng độ 10-5 có số khuẩn lạc >300, kết quả >3,0.107. Nếu ở nồng độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <30, vd: ở nồng độ 10-1 số khuẩn lạc đếm được <30, kết quả 0,3.102 (CFU/g). Nếu ở nồng độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa bằng 0, vd: ở nồng độ pha loãng 10-1 số khuẩn lạc đếm được bằng 0, kết quả <1,0.101 (CFU/g).
2.2. Xác định vi khuẩn E.coli bằng phương pháp định tínha) Phạm vi ứng dụng a) Phạm vi ứng dụng
Phương pháp này (tham chiếu theo TCVN 5287 – 1990) dùng để phát hiện vi khuẩn E.coli trong tất cả thực phẩm.
b) Nguyên tắc
E.coli là dạng Coliforms có nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 440C +
0,50C, sinh Indol, sinh acid, không sinh axeton, không dùng Citrat làm nguồn Cacbon. E.coli được phát hiện do khả năng lên men lactose sinh hơi ở 440+ 0,50C và có kết quả kiếm IMVC phù hợp.
Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch đệm hay nước muối sinh lý 0,85%. Môi trường phân lập EMB agar (Eosin Methylene Blue agar )
Môi trường pha sẵn:
+ EMB 7,5g.
+ Nước cất 200ml.
+ Tiến hành: Cân cho vào bình tam giác 7,5g thạch tổng hợp EMB và 200ml nước cất, khuấy tan đều. Hấp thanh trùng 1210C/15 phút. Để nguội và bảo quản nơi khô ráo.
Môi trường BGBL (Green Bile Lactose Btoth).
Môi trường pha sẵn: BGBL khan 40g. Nước cất 1000ml. − Môi trường tự pha:
+ Peptol 10g.
+ Lactose 10g.
+ Mật bò 20g.
+ Brillian Green 0,0133g.
+ Nước cất 1000ml.
+ Tiến hành: cân thật chính xác các chất trên cho vào becher. Đối với môi trường tự pha thì hòa tan peptone và lactose vào trong 50ml dung dịch nước cất, mật bò vào 200ml và Brilliant Freen vào 100ml. Trộn đều 3 dung dịch trên, bổ sung nước cất cho đủ 1000ml. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho hòa tan. Điều chỉnh pH = 7,4. Phân phối vào mỗi ống nghiệm có ống Durham 10ml. Dùng bông không thấm nhét kín ống nghiệm, xếp vào hộp nhựa và ghi tên môi trường, ngày pha chế. Hấp tuyệt trùng ở 1210C/15 – 20 phút, để nguội và bảo quản ở nơi khô mát.
Canh peptol thử Indol: cân vào cốc thủy tinh 3g peptone, thêm nước cất cho đủ 200ml. Khuấy đều và đun cho tan chảy hoàn toàn. Rót ra ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Đậy nấp và hấp khử trùng ở 1210C/15 – 20 phút.
Canh Clark & Lubs:
+ Peptol 1,4g.
+ K2PO4 1g.
+ Glucose 1g.
+ Nước cất 200ml.
+ Tiến hành: cân các loại hóa chất trên cho vào cốc, thêm nước cho đủ 200ml. Khuấy đều và đun cho tan chảy hoàn toàn. Rót ra ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Đậy nấp và hấp khử trùng ở 1210C/15 – 20 phút. Bảo quản trong tủ lạnh.
Môi trường pha sẵn:
Milieu de simons 4,2g.
Nước cất 200ml.
+ Tiến hành: Cân hóa chất trên cho vào cốc, thêm nước cho đủ 200ml. Khuấy đều và đun cho tan chảy hoàn toàn. Rót ra ống nghiệm, mỗi ống 200ml. Đậy nấp và hấp khử trùng ở 1210C/20 phút. Đem ra đặt nghiên so với mặt phẳng một góc khoảng 10 – 150 để tạo mặt phẳng nghiên sau khi thạch đông. Bảo quản trong tủ lạnh.
Thuốc thử Kovacs, Methylred 0,2%, dung dịch α – naphtol 5%, dung dịch KOH 20%.
d) Chuẩn bị mẫu
Mẫu đông lạnh được bảo quản ở nhiệt độ dưới 00C. Đối với mẫu thường bảo quản nơi khô ráo thoáng mát, sạch sẽ ở nhiệt độ phòng.
Lương lấy mẫu phân tích có trọng lượng không dưới 200g. Mẫu được mã hóa dựa vào số thứ tự trong số nhận mẫu.
Xếp mẫu gọn gàng ra khay theo thứ tự, thị trường. Mẫu đông lạnh được rã đông tư nhiên trước khi phá mẫu trong khoảng nhiệt độ từ 00C – 40C.
e) Chuẩn bị dụng cụ
Bao dập mẫu (vô trùng). Dùng bút lông ghi rõ ràng mã số lên giữa bao dập mẫu. Đĩa petri (vô trùng). Dùng bút lông ghi rõ thông tin sau: số mã hoá, ngày thực hiện, tên môi trường (hay tên chỉ tiêu), nồng độ pha loãng.
f) Tiến hành phân tích
Cắt mẫu: dùng kéo vô trùng cắt sát trên miệng bao mẫu tránh đụng mẫu bên trong. Dùng kéo vô trùng khác cắt ít nhất 10 điểm đại diện trên mẫu với trọng lượng 10+0,1g cho vào bao dập mẫu vô trùng lường 90ml dung dịch pha loãng mẫu đổ vào bao dập mẫu và đồng nhất mẫu trên máy dập mẫu trong thời gian 30 giây, ta được dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-1.
Cách pha loãng mẫu: dùng pipette ( thường loại 5ml có chia độ ) vô trùng hút 1ml dung dịch mẫu có nồng độ 10-1 ở trên cho vào ống nghiệm có sẵn 9ml dung dịch nước muối sinh lý ( 0,85% NaCl ) vô trùng, lắc đồng nhất trên máy lắc ta được dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-2.
Tăng sinh: hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 5ml canh dung dịch BGBL có sẵn ống durham, ủ ở 440C + 0,50C/24 – 48 giờ.
Phân lập: sau 24 – 48 giờ, chọn ống nghiệm có phản ứng làm cho môi trường BGBL từ màu xanh sang màu vàng có sinh hơi trong ống durham để cấy
chuyển sang môi trường phân lập EMB, ủ 370C/24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc E.coli: khuẩn lạc màu tím ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng 0,5mm.
Thử test sinh hóa:
Indol: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,5ml nước peptol ủ 370C/48 giờ. Cho vào ống nghiệm vài giọt methylred ở PH trung tình hay kiềm yếu.
Dung dịch methylred vẫn màu đỏ: MR (+).
Dung dịch methylred chuyển đỏ sang vàng: MR (-).
VP: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vài ống nghiệm chứa canh Clark & Lubs, cho vào ống nghiệm 0,6ml dung dịch α – naptol 5% và 0,2ml dung dịch KOH 20%.
Môi trường chuyển sang mày đỏ eosin hay có vệt đỏ eosin phát triên trong 15 phút: VP (+).
Môi trường không chuyển đỏ: VP (-).
Citrat: cấy rìa khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt nghiên của môi trường Simons Citrat, ủ 370C/24 giờ.
Môi trường chuyển màu lục sang xanh dương và xuất hiện khuẩn lạc: Citrat (+).
Môi trường không chuyển màu, không xuất hiện khuẩn lạc: Citrat (-).
2.3. Xác định vi khuẩn Staphylococcus aureus bằng phương pháp định tính, định lượng ( đổ đĩa và trải trùng ) lượng ( đổ đĩa và trải trùng )