- Trãi trùng: để thạch đông hoàn toàn, lật đĩa và xếp gọn đĩa vào tủ ấm, ủở 370C/24 – 48 giờ.
c) Môi trường nuôi cấy:
Dung dịch peptone đệm (Buffered peptone Water )
− Peptone 10g.
− NaCl 5g.
− Na2HPO4 9g.
− KH2PO4 1,5g.
− Nước trao đổi ion đã vô trùng 1000ml.
Tiến hành: cân 1000ml nước cất cho vào bình tam giác 1000ml. Cân chính xác các thành phần môi trường nói trên cho vào bình tam giác. Đóng miệng bình bằng nút bông không thấm, bịch giấy nhôm kín miệng bình. Hấp thanh trùng 1210C/15 – 20 phút. Để nguội, bảo quản trong tủ lạnh hoặc nơi khô ráo.
Canh Tetrathionnate de Muller-Kauffmann:
− Tetrathionnate de Muller-Kauffmann 16,4g.
− Nước trao đổi ion 200ml.
− Tiến hành: cân 14,6g Tetrathionnate de Muller-kauffmann cho vào bình tam giác chứa 200ml nuớc cất vô trùng, lắc đều đun sôi cho tan dần. Làm nguội khoảng 450C. Cho vào các dung dịch sau: 3,8ml dung dịch iod KL; 1,9ml dung dịch brilliant green 0,1%. Lắc đều và phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 10ml. Bào quản trong tủ lạnh dưới 50C.
Thạch Xylone Lysine Desoxycholate ( XLD ): Môi trường pha sẵn:
− XLD 5,5g.
− Nước trao đổi ion vô trùng 100ml. Môi trường tự pha:
− Cao nấm men 3g.
− L – lysine 5g.
− Xylose 3,75g.
− Sucrose 7,5g.
− Sodium desoxycholate 2,5g. − Ferric ammonium citrate 0,8g. − Sodium thiosulsafe 6,8g.
− NaCl 5g.
− Agar 15g.
− Phenol red 0,08g.
− Nước trao đổi ion 1000ml.
− Tiến hành: đong 100ml nước cất cho vào bình tam giác 100ml. Cân chính xác các thành phần môi trường nói trên tương ứng với 100ml cho vào bình nước cất nói trên. Đóng miệng bình bằng nút bông không thấm, bịt giấy nhôm kín miệng bình. Đun sôi cho tan, không hấp thanh trùng. Để nguội đến khoảng 450C và đổ ra đĩa petri. Bảo quản trong tủ lạnh không để quá 24giờ.
d) Tiến hành phân tích
Tiền tăng sinh: cắt đại diện 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, thêm 225ml dung dịch peptone đệm và đồng nhất trên máy dập mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu tuỳ tùy thuộc vào loại cơ chất của mẫu. Ủ túi mẫu vào tủ ấm 370+10C/15 – 24 giờ.
Tăng sinh: trộn đều túi mẫu sau khi ủ ở trên, sau đó cấu chuyển 0,1ml sang ống nghiệm có sẵn 10ml canh Tetrathionnate de Muller-Kauffmann tiệt trùng. Ủ ở 420+10C/18 – 24 giờ trong bể điều nhiệt.
Phân lập và đọc kết quả trên đĩa: dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ canh tăng sinh sau khi ủ ở trên lên mặt đĩa thạch XLD để tạo những khuẩn lạc riêng rẻ và ử ở 370+10C/18 – 24 giờ. Khi gặp khuẩn lạc nghi ngờ thì gửi mẫu sang viện Pasteur để thực hiện test kháng huyết thanh và kết luận.
2.5. Xác định Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp định tínha) Phạm vi ứng dụng a) Phạm vi ứng dụng
Phương pháp này (tham chiếu theo AOAC 988:20, association of official analytical chemists: hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thức) được áp dụng nhằm phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong tất cả các loại thực phẩm. Riêng đến giai đoạn khẳng định thì được gửi sang viện Pasteur thực hiện và kết luận.
b) Nguyên tắc
Chuyển 25g mẫu vào canh Colistine Polymyxin Broth (Colistine), phân lập và chọn lọc các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch chọn lọc, sau đó xác định bằng phản ứng đặc trưng.