- Phƣơng phỏp tỏch chiết ADN tổng số: 19 mẫu lỳa địa phƣơng đƣợc tỏch chiết theo phƣơng phỏp CTAB của Saghai Marof (1984) cải tiến Qui trỡnh
3.3. Kết quả đỏnh giỏ đa dạng di truyền và khả năng chịu mặn của cỏc giống lỳa địa phƣơng bằng chỉ thị SSR
địa phƣơng bằng chỉ thị SSR
Cỏc giống lỳa địa phƣơng sau khi tỏch chiết đó đƣợc kiểm tra nồng độ và độ nguyờn vẹn trờn gel agarose 1%, với λ50. Kết quả cho thấy cỏc mẫu ADN thu đƣợc đều nguyờn vẹn đảm bảo cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo (Hỡnh 3.1). Cỏc mẫu ADN sau khi kiểm tra đƣợc pha loóng xuống nồng độ 5ng/àl để tiếp tục sử dụng trong phản ứng PCR. Để đỏnh giỏ đa dạng di truyền liờn quan đến tớnh chịu mặn của 19 nguồn gen lỳa, chỳng tụi đó chọn lựa 13 cặp mồi SSR từ http://gramene.org (Bảng 3.6). Cỏc cặp mồi này đƣợc xỏc định là cú liờn kết với gen/QTL cú khả năng chịu mặn và lập bản đồ từ cỏc nghiờn cứu đó đƣợc cụng bố trƣớc đú. ADN cỏc nguồn gen lỳa nghiờn cứu sau khi tỏch chiết đó đƣợc sử dụng để làm khuụn mẫu cho cỏc phản ứng PCR.
Bảng 3.6. Đa hỡnh cỏc locut SSR ở 19 nguồn gen lỳa địa phƣơng
STT Locut NST Kiểu lặp Số băng đa hỡnh PIC
1 RM 09 1 (GA)15GT(GA)2 9 0,87 2 RM 17 12 (GA)21 9 0,83 3 RM 25 8 (GA)18 7 0,68 4 RM 140 1 (CT)12 9 0,85 5 RM 210 8 (CT)23 5 0,76 6 RM 215 9 (CT)16 6 0,80 7 RM 223 8 (CT)25 7 0,78 8 RM 231 3 (CT)16 6 0,79 9 RM 493 1 (CTT)9 9 0,86 10 RM 518 4 (TC)15 7 0,74 11 RM 3412 1 (CT)17 9 0,85 12 RM 5371 6 (TC)13 4 0,70 13 RM 10745 1 (TATG)9 6 0,77 Tổng 93 Min 4 0,87 Max 9 0,68 Trung bỡnh 7.15 0,79
Ghi chỳ: NST: Nhiễm sắc thể; PIC: Hệ số đa dạng gen
Kết quả phõn tớch cho thấy, 13 chỉ thị SSR lựa chọn đều cho đa hỡnh ở 19 nguồn gen lỳa địa phƣơng (Hỡnh 3.2), với tổng số băng đa hỡnh là 93, trờn mỗi locut số băng đa hỡnh biến động từ 4 đến 9, đạt trung bỡnh là 7,15, nhiều chỉ thị cho số băng đa hỡnh nhiều nhất là 9, trong đú 3 chỉ thị RM3412, RM 493 và MR 140 cú hệ số đa dạng di truyền PIC (Polymorphism Information Content) cao nhất (0,85 tới 0,86). Kết quả tổng hợp từ bảng 3.2 cho thấy chỉ số PIC của cỏc chỉ thị SSR nghiờn cứu biến động từ 0,68 đến 0,87, đạt trung bỡnh 0,79, chứng tỏ độ đa dạng gen tồn tại trong 19 nguồn gen nghiờn cứu ở mức khỏ cao. Điều này đƣợc lý giải là do nghiờn cứu đó sử dụng cỏc chỉ thị SSR cú số lần lặp nhiều hoặc chuỗi trỡnh tự lặp dài. Theo cỏc nghiờn cứu trƣớc đõy của Temnykh.S et a.l (2001) [134], Yu, S. B. et al. (2003) [139] thỡ số băng đa hỡnh và giỏ trị PIC phụ thuộc nhiều vào số lần lặp và trỡnh tự lặp. Đồng thời
Ni Junjian et al. (2002) [120], đó chứng minh đa số cỏc chỉ thị SSR cú dạng lặp (GA)n với số lần lặp lớn thỡ số băng đa hỡnh và giỏ trị PIC sẽ cao, trong khi đú Temnykh S. et al (2002) [135], lại cho thấy dạng lặp (CTT)n và cỏc trỡnh tự lặp từ 3 nucleotic trở lờn giàu (AT) thỡ sẽ đƣợc khuếch đại tốt hơn và sự đa hỡnh cao hơn.
Hỡnh 3.2. Kết quả nhận dạng di truyền 19 nguồn gen nghiờn cứu bằng chỉ thị SSR-RM140, RM493 và RM3412
Số liệu cỏc băng ADN ghi nhận ở 19 nguồn gen lỳa địa phƣơng khi sử dụng 13 chỉ thị SSR sẽ đƣợc xử lý theo phƣơng phỏp SM-UPGMA bằng phần mềm NTSYSpc 2.1. Kết quả phõn tớch cho thấy, tại mức tƣơng đồng di truyền 0,75, 19 nguồn gen lỳa đƣợc phõn thành 2 nhúm chớnh (Hỡnh 3.3)
- Nhúm I: đƣợc phõn thành 3 nhúm nhỏ Ia, Ib, Ic. Trong đú nhúm Ia phõn thành 2 nhỏnh với mức độ tƣơng đồng là 0,78. Một nhỏnh gồm nguồn gen Chiờm đen (SĐK 4707) và Tộp Lai (SĐK 8192) với khả năng chịu mặn kộm cú mức tƣơng đồng di truyền là 0,82 so với nguồn gen IR28 – là giống chuẩn nhiễm mặn. Nhỏnh cũn lại gồm 2 nguồn gen Lỳa chăm (SĐK 5127) và Lỳa chăm biển (SĐK 6234) đều đƣợc đỏnh giỏ là cú khả năng chịu mặn tốt, đặc biệt là giống A69-1 đó đƣợc cụng bố là giống chịu mặn một số nghiờn cứu trƣớc đõy, Nguyen Thach Can et al. (2002) [122]. Tƣơng
tự, nhúm Ic cũng gồm 2 nguồn gen cú khả năng chịu mặn tốt là Nƣớc mặn dạng 1 (SĐK 3443) và A69-1 (SĐK 6157). Trong khi đú nhúm Ic phõn tỏch với nhúm Ib và Ia tại mức độ tƣơng đồng di truyền là 0.78, cú cỏc nguồn gen cú khả năng chịu mặn khỏ và tốt gồm Cƣờm dạng 1 (SĐK 6188), Nếp Ốc (SĐK 6192), Chiờm rong (SĐK 6191) và Nếp nừn tre (SĐK 6196).
- Nhúm II: với mức tƣơng đồng di truyền 0,78 gồm nhúm IIa và IIb. Nhúm IIa gồm 2 nguồn gen Hom rõu (cú SĐK lần lƣợt là 6182 và 6183) và Lỳa ngoi (SĐK 4705) phõn nhỏnh cựng giống chuẩn khỏng Pokkali. Trong khi đú nhúm IIb gồm 2 nguồn gen cú khả năng chịu mặn kộm là Hom rõu (SĐK 6190) và Nếp vải (SĐK 6193).
Hỡnh 3.3. Cõy phõn nhúm di truyền SM-UPGMA dựa trờn kiểu gen SSR của 19 nguồn gen lỳa nghiờn cứu
Kết quả nghiờn cứu cho thấy, đa dạng di truyền của 19 nguồn gen lỳa với mức tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,74 đến 0,90, bờn cạnh đú cỏc nguồn gen đƣợc phõn thành 5 nhúm cú khả năng chịu mặn khỏc nhau tại mức tƣơng đồng di truyền 0,78. Trong đú 4 nhúm Ib, Ic, IIb và IIa là cú khả năng chịu mặn từ khỏ đến tốt, nhúm Ia khả năng chịu mặn kộm hơn. Sử dụng chỉ thị SSR liờn kết với gen chống chịu mặn để đỏnh giỏ đa dạng di truyền của 19 nguồn gen lỳa địa phƣơng cho mức tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,74 đến 0,90. Bờn cạnh đú, 19 nguồn gen lỳa
đó đƣợc phõn thành 5 nhúm, trong đú cú 4 nhúm cú khả năng chịu mặn khỏc nhau tại mức tƣơng đồng di truyền 0,78. Kết quả tổng hợp từ đa hỡnh cỏc locut SSR ở 19 nguồn gen lỳa nghiờn cứu cho thấy chỉ số PIC của cỏc chỉ thị SSR nghiờn cứu biến động từ 0,68 đến 0,87, đạt trung bỡnh 0,79, chứng tỏ độ đa dạng gen tồn tại trong 19 nguồn gen nghiờn cứu ở mức khỏ cao.
Từ kết quả nghiờn cứu đa dạng di truyền liờn quan đến tớnh chịu mặn đó chọn lọc cỏc nguồn gen điển hỡnh cú khả năng chịu mặn thuộc 5 phõn nhúm khỏc nhau với mức độ tƣơng đồng là 0,78 là cỏc nguồn gen nƣớc mặn dạng 1 (SĐK 3443), A69-1 (SĐK 6157), Lỳa chăm (SĐK 5127) và Lỳa chăm biển (SĐK 6234), Cƣờm dạng 1 (SĐK 6188), Chiờm rong (SĐK 6191), Nếp Ốc (SĐK 6192), Nếp Nừn tre (SĐK 6196).
Bảng 3.7. Hệ số tƣơng đồng của 19 nguồn gen lỳa địa phƣơng đại diện ngõn hàng gen cõy trồng quốc gia
Giống IR28 Pok 3443 4705 4707 5127 6157 6182 6183 6188 6189 6190 6191 6192 6193 6196 6234 7350 8192 IR28 1.00 Pok 0.74 1.00 3443 0.81 0.76 1.00 4705 0.76 0.76 0.76 1.00 4707 0.81 0.78 0.81 0.74 1.00 5127 0.81 0.76 0.76 0.76 0.81 1.00 6157 0.76 0.76 0.83 0.76 0.76 0.78 1.00 6182 0.73 0.80 0.71 0.82 0.77 0.77 0.73 1.00 6183 0.74 0.76 0.72 0.83 0.74 0.74 0.72 0.90 1.00 6188 0.83 0.74 0.81 0.78 0.81 0.81 0.76 0.73 0.74 1.00 6189 0.77 0.73 0.75 0.75 0.80 0.73 0.71 0.74 0.73 0.90 1.00 6190 0.75 0.71 0.73 0.80 0.71 0.71 0.73 0.76 0.77 0.73 0.74 1.00 6191 0.76 0.74 0.74 0.76 0.74 0.76 0.74 0.77 0.76 0.76 0.80 0.71 1.00 6192 0.76 0.76 0.76 0.78 0.76 0.74 0.74 0.75 0.74 0.85 0.86 0.75 0.85 1.00 6193 0.73 0.73 0.73 0.75 0.75 0.75 0.75 0.81 0.75 0.71 0.72 0.83 0.75 0.73 1.00 6196 0.74 0.74 0.74 0.74 0.72 0.78 0.76 0.71 0.72 0.83 0.82 0.71 0.81 0.83 0.71 1.00 6234 0.80 0.75 0.75 0.77 0.77 0.86 0.77 0.74 0.75 0.80 0.74 0.72 0.77 0.80 0.74 0.84 1.00 7350 0.74 0.76 0.76 0.72 0.72 0.76 0.74 0.71 0.72 0.78 0.75 0.71 0.76 0.81 0.73 0.87 0.80 1.00 8192 0.80 0.71 0.75 0.71 0.82 0.75 0.71 0.72 0.71 0.82 0.78 0.70 0.75 0.77 0.74 0.77 0.78 0.80 1.00