1.2.1.1. Vai trũ của đa dạng di truyền trong cải tiến giống lỳa chịu mặn
Ngõn Hàng Gen thế giới đang lƣu giữ 572.029 mẫu giống lỳa trồng (Oryza sativa và Oryza glaberrima) và khoảng 23.000 mẫu lỳa hoang, tại 6 ngõn hàng gen lớn, tất cả nằm ở Chõu Á (http://rice.generationcp.org), trong đú, Ngõn hàng Gen Việt Nam cú khoảng trờn 7.000 mẫu giống. Đa dạng di truyền cõy lỳa sẽ cú thể thỏa món đƣợc mục tiờu tạo giống thớch ứng với biến đổi khớ hậu thụng qua chƣơng trỡnh “Gene Mining” (Tỡm mỏ gen). Cỏc nƣớc đều đặt nội dung bảo tồn nhƣ vậy nhƣ chiến lƣợc phỏt triển cơ bản quốc gia cho cụng nghệ sinh học và cỏch mạng xanh tƣơng lai. Bản chất của cụng nghệ di truyền tập trung vào 3
nội dung: Ngõn hàng gen (giống), cụng nghệ khả thi (chuyển nạp gen, marker chọn lọc cải biờn theo hƣớng an toàn thớ dụ pmi, promoter đa chức năng, v.v...), thực hiện cỏc cụng nghệ ấy đối với cỏc gen điều khiển những tớnh trạng mong muốn. Cụng ƣớc đa dạng sinh học đó đƣợc 126 quốc gia ký kết, trong đú cú Việt Nam. Hiệp Ƣớc Quốc tế về Tài nguyờn di truyền thực vật cho Lƣơng thực và Nụng nghiệp (ITPGRFA) đƣợc ký ban hành vào năm 2001 và thực sự cú hiệu lực vào ngày 29-6-2004. Đến 31-8-2010, cú 125 quốc gia thành viờn chấp nhận cỏc điều khoản của Hiệp ƣớc này. Thế giới hiện cú 1.700 Ngõn hàng gen, trong đú 11 Ngõn hàng gen thuộc CGIAR với 650.000 mẫu giống đƣợc bảo quản ex-situ. Trung tõm bảo quản ex-situ lớn nhất là Global Seed Vault ở Svalbard, Na Uy. Việc tỡm kiếm, phỏt hiện gen qỳi hiếm phục vụ cho an ninh lƣơng thực và đề ra cỏc giải phỏp tốt đối với bệnh khiếm dƣỡng đƣợc khuyến khớch. Đa dạng genome và nguồn gốc của genome đƣợc dựa trờn cơ sở di truyền tiến húa theo nghiờn cứu của Đại học Indiana, Hoa Kỳ [102]. Di truyền quần thể thỳc đẩy sự phỏt triển hoặc làm mất đi genome của loài sinh vật nào đú trờn trỏi đất, tựy thuộc vào: (1) số gen/loài sinh vật; (2) tớnh chất đa dạng của vựng điều tiết trong genome; (3) hiện tƣợng “intron proliferation” hay “spliceosomal” trong nhõn; (4) hiện tƣợng transposon và retrotransposon. Qui mụ của quần thể thƣờng tƣơng quan nghịch với kớch thƣớc của sinh vật. Số lƣợng intron trong một gen tiến dần đến giới hạn tại qui mụ intron nhỏ nhất [102]. Lĩnh vực di truyền quần thể đó cụng bố nhiều mụ hỡnh toỏn học mới giỳp ớch cho nghiờn cứu di truyền của ngƣời, với cụng trỡnh của GS Bruce Weir, ĐH North Carolina, USA [8]. Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa cỏc cỏ thể trong cựng một loài và giữa cỏc loài khỏc nhau; sự đa dạng về gen cú thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa cỏc quần thể. Nghiờn cứu đa dạng di truyền cũn giỳp đỏnh giỏ nguồn tài nguyờn di truyền của tập đoàn giống cõy trồng, vật nuụi, giỳp cho việc sử dụng nguồn tài nguyờn di truyền hiệu quả hơn. Đặc biệt, nghiờn cứu đa dạng di truyền cú thể giỳp tiờn đoỏn khả năng cho ƣu thế lai giữa cỏc cặp bố mẹ (Cặp bố mẹ nào cú khoảng cỏch di truyền xa hơn thƣờng sẽ cho ƣu thế lai lớn hơn).
Một số chỉ số cần thiết:
Tƣơng đồng di truyền giữa 2 mẫu: I =
21 1 12 Q Q q
Khoảng cỏch di truyền giữa 2 mẫu: D = – ln(I)
Trong đú: q12 - số cỏc alen đồng nhất ở cả 2 mẫu; Q1 và Q2 - tổng số cỏc alen của mẫu 1 và mẫu 2
Tƣơng đồng di truyền: biến thiờn từ 0 đến 1. Cỏc mẫu cú độ tƣơng đồng càng gần trị số 1 thỡ chỳng cú mức độ tƣơng đồng di truyền càng lớn hơn. Khoảng cỏch di truyền: biến thiờn từ 0 đến ∞. Cỏc mẫu cú khoảng cỏch di truyền gần tới trị số 0 thỡ chỳng càng gần nhau. Cỏc mẫu cú khoảng cỏch di truyền càng lớn thỡ chỳng càng xa nhau (về phƣơng diện di truyền). Dựa vào tƣơng đồng di truyền hoặc khoảng cỏch di truyền, ngƣời ta thiết lập sơ đồ cõy. Sơ đồ cõy phản ỏnh trực quan cỏc nhúm mẫu gần nhau hay xa nhau.
Một số chƣơng trỡnh phõn tớch đa dạng di truyền
+ NTSYS: Rất phổ biến. Sử dụng cỏc thụng số “1” hay “+” (cú mặt), và “0” hay “-“(vắng mặt). Cú thể dựng chƣơng trỡnh NTSYS cho cỏc chỉ thị phõn tử RAPD, AFLP hay cỏc chỉ thị “trội’ khỏc.
+ PopGene: Tƣơng đối phổ biến. Sử dụng cỏc thụng số “1” (cú mặt), và “0” (vắng mặt) trong trƣờng hợp chỉ thị di truyền là “trội”, hoặc cỏc thụng số AA, BB, CC, AB, AC, BC... trong trƣờng hợp chỉ thị di truyền là “đồng trội”. Ngoài ra, PopGene cũn đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp cần đỏnh giỏ những mẫu vật của nhiều quần thể hoặc nhúm cỏc quần thể.
Trong phõn tớch tớnh đa dạng di truyền, ở dạng đơn lẻ hay nhúm thỡ cỏc chỉ thị phõn tử cú thể sinh ra những mẫu đặc trƣng cho mỗi kiểu gen cỏ thể [73]. Tớnh đa dạng di truyền là cơ sở tạo nờn ƣu thế lai. Khi sự đa dạng di truyền của bố mẹ tham gia lai càng lớn thỡ sự biểu hiện ƣu thế lai càng mạnh. Dựa vào chỉ thị phõn tử cú thể xỏc định tớnh đa dạng di truyền giữa cỏc giống, cỏc loài, giữa cỏc cỏ thể cựng loài. Do đú, cần thiết phải nghiờn cứu một cỏch tổng hợp về vốn gen của giống đang hiện hành để so sỏnh với tổ tiờn của chỳng và cỏc loài thõn thuộc. Điều
này khụng chỉ cung cấp thụng tin về mối quan hệ họ hàng mà cũn giỳp nhận biết những gen mới và cú ớch. Những kỹ thuật phõn tử khỏc nhau đó và đang đƣợc ứng dụng trong nghiờn cứu đa hỡnh ADN nhƣ: kỹ thuật đa hỡnh độ dài mảnh phõn cắt giới hạn (RFLP), đa hỡnh AND nhõn bội ngẫu nhiờn (RAPD) và vi vệ tinh [103], và gần đõy là đa hỡnh chiều dài mảnh phõn cắt giới hạn đƣợc nhõn bội AFLP. Trong số cỏc kỹ thuật RFLP, RAPD, SSR, AFLP, STS thỡ kỹ thuật AFLP cho kết quả nhanh đỡ tốn kộm AND, đỏng tin cậy và khả năng cho đa hỡnh cao. Nhƣợc điểm của kỹ thuật này là khú thao tỏc và khụng xỏc định đƣợc vị trớ của chỉ thị tỡm đƣợc trờn NST. Cỏc nhà khoa học đó sử dụng phƣơng phỏp RAPD-PCR để đỏnh giỏ sự thay đổi về di truyền trong 23 mẫu quần thể Oryza granulata thu thập đƣợc từ cỏc vựng phõn bố chớnh trờn thế giới. Kỹ thuật PCR này tạo ra hàng trăm chuỗi trỡnh tự cú độ dài phõn tử khỏc nhau đƣợc ghi nhận, từ đú tạo ra một ADN hay profile cú thể phõn biệt giữa cỏc loài. Cỏc tỏc giả cho biết phõn tớch giống lỳa
Oryza granulata bằng phƣơng phỏp này cho thấy mức độ biến đổi di truyền từ thấp tới cao trong cỏc loại lỳa dại. Việc đỏnh giỏ đa dạng di truyền cú một vai trũ nữa là giỳp thu thập và xõy dựng một nguồn gen hạt nhõn (core collection) để sử dụng trong lai tạo giống. Quỹ gen là một tập hợp rất lớn biến dị di truyền, do vậy chọn đại diện cho cỏc biến dị của nguồn gen phục vụ cho cỏc mục tiờu tạo giống khỏc nhau là rất cần thiết, mở rộng nền tảng di truyền của giống cõy trồng. Phõn tớch AFLP cũng đó đƣợc ứng dụng trong nghiờn cứu đa dạng di truyền của 42 giống lỳa thuộc loài phụ indica, sử dụng 6 tổ hợp của 2 cặp mồi PstI và MseI [88]. Trong phõn loại học, những chỉ thị phõn tử phản ỏnh những thay đổi cú thể di truyền trong trỡnh tự chuỗi ở cả những vựng mó húa và khụng mó hoỏ. Bởi vậy nú cung cấp thờm những cụng cụ cho việc khỏm phỏ sự biến đổi loài và mối quan hệ chủng loại phỏt sinh giữa cỏc quần thể và giữa cỏc loài [68]. Những chỉ thị phõn tử AND nhậy hơn và cũng cú nhiều hơn những chỉ thị protein [94].
Đỏnh giỏ đa dạng di truyền là bƣớc quan trọng trong cụng tỏc cải tiến giống, nhất là đối với những giống cõy trồng bắt nguồn từ một nền tảng di truyền hẹp. Việc chọn lọc giống chỉ căn cứ trờn năng suất qua nhiều năm đó làm thất thoỏt những nguồn gen quý giỏ nhƣ cỏc gen khỏng bệnh và khỏng cỏc yếu tố vụ sinh khỏc (giú,
độ mặn, khớ hậu lạnh). Hiện nay cỏc nhà khoa học đang quay lại tỡm những nguồn gen đú trong cỏc loài hoang dại (đƣợc lƣu trữ trong quỹ gen) [99]. Tại Viện khoa học Nụng nghiệp Trung Quốc đó tiến hành cỏc nghiờn cứu về “sự đa dạng di truyền trong việc tiếp cận giống lỳa hoang dó Oryza granulata từ miền Nam và Đụng nam Chõu Á”. Nghiờn cứu sử dụng chỉ thị phõn tử để xỏc định khoảng cỏch di truyền giữa cỏc dũng bố mẹ trong tập đoàn cỏc giống lỳa thuộc 3 loài phụ khỏc nhau
(Indica, Japonica, Javanica) đó đƣợc tập trung nghiờn cứu mạnh mẽ ở nhiều phũng
thớ nghiệm trờn thế giới [76]. Mục tiờu của cỏc nghiờn cứu này nhằm xỏc định khoảng cỏch di truyền giữa cỏc bố, mẹ để cú thể chọn tổ hợp lai cho ƣu thế lai cao một cỏch chớnh xỏc. Khắc phục những yếu điểm chớnh của chọn tạo giống theo phƣơng phỏp truyền thống là tốn kộm nhõn cụng và đũi hỏi thời gian dài. Việc sử dụng chỉ thị phõn tử trong chọn giống lỳa cú thể nhanh chúng chớnh xỏc đƣợc sự đa dạng di truyền của cỏc vật liệu, đồng thời giỳp cỏc nhà chọn giống lựa chọn cho bố mẹ của tổ hợp lai cho ƣu thế lai cao thay vỡ phải lai hàng ngàn cặp rồi đỏnh giỏ chọn lọc, lai thử lại, đỏnh giỏ và khảo nghiệm để tỡm ra tổ hợp mong muốn theo phƣơng phỏp truyền thống. Những hoạt động đầu tiờn biểu thị rừ nhất trong bảo tồn quỹ gen và chọn tạo giống lỳa. Chỉ thị phõn tử AFLP, SSR đó đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiờn cứu đa dạng di truyền cõy lỳa (Oryza sativa L.) [63], [74] đó cụng bố đa dạng di truyền của hoạt động điều tiết gen waxy. Dũng húa gen mục tiờu nhờ BAC clone đƣợc thực hiện trờn gen Xa-21, Bph-10 [8]. Gần đõy, gen giả định điều khiển tớnh chống chịu hạn trờn nhiễm sắc thể số 9 cũng đƣợc dũng húa [30] trờn cơ sở thành lập thƣ viện BAC của Viện Lỳa ĐBSCL. Gen điều khiển mựi thơn fgr đƣợc phỏt hiện nhờ microsatellite thụng qua kỹ thuật “fine mapping” trờn đoạn phõn tử liờn kết chặt với RG28 của nhiễm sắc thể số 8, và ỏp dụng MAS để chọn dũng lai cú fgr [8]. Giống OM6162, OM4900 đƣợc phỏt triển thành cụng ra sản xuất bằng phƣơng tiện này. Gen mục tiờu từ loài lỳa hoang đƣợc du nhập thành cụng vào lỳa trồng thụng qua kỹ thuật cứu sống phụi mầm (embryo rescue). Thao tỏc trờn nhiễm sắc thể đƣợc thực hiện thụng qua kỹ thuật FISH (fluorescent
in-situ hybridization) khi lai với lỳa hoang. Giống dẫn xuất từ lỳa hoang Oryza rufipogon cú nguồn gốc từ đất phốn nặng ở Tràm Chim, Đồng Thỏp Mƣời là AS996 (IR64 x Oryza rufipogon) đó đƣợc sử dụng làm vật liệu trong cỏc chƣơng trỡnh lai [8].
Phõn tớch QTL (quantitative trait loci) cỏc tớnh trạng số lƣợng nhƣ chống chịu khụ hạn, mặn [8], chống chịu thiếu lõn [10], chống chịu độ độc nhụm [57], chống chịu độ độc sắt [63]. Tƣơng tỏc GxE đƣợc tớnh toỏn trong phõn tớch QTL cỏc tớnh trạng chống chịu với stress phi sinh học, vẫn cũn là thỏch thức lớn cho nhà chọn giống. Cỏc nghiờn cứu chống chịu hạn trờn cơ sở kiểu hỡnh của rễ để xõy dựng bản đồ QTL cũng đƣợc quan tõm [100]. Nghiờn cứu tớnh trạng chống chịu mặn trờn 6 kiểu hỡnh: SD (ngày sống sút), chiều dài chồi, chiều dài rễ, khối lƣợng chồi, khối lƣợng rễ, hàm lƣợng K và Na, tỷ lệ Na/K đó đƣợc phỏt triển để hỡnh thành bản đồ QTL, từ đú nhiễm sắc thể số 8 đó đƣợc ứng dụng để tỡm gen mục tiờu tạo ra giống lỳa chịu mặn ở ĐBSCL [8].
1.2.1.2. Nghiờn cứu di truyền tớnh chịu mặn của cõy lỳa
Phần lớn những tớnh trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do mụi trƣờng là tớnh trạng di truyền số lƣợng. Tớnh trạng số lƣợng đƣợc định nghĩa một cỏch kinh điển là tớnh trạng cú phõn bố liờn tục (continuous distribution), tớnh trạng này đƣợc điều khiển bởi nhiều gen, mỗi gen cú một ảnh hƣởng nhỏ đối với tớnh trạng mục tiờu. Đó cú khỏ nhiều cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu sự di truyền của tớnh chống chịu mặn. Theo Mishra et al., 1990 [111], tớnh trạng chống chịu mặn là một tớnh trạng di truyền đa gen, khụng cú ảnh hƣởng của cõy mẹ (khụng phải là cỏc gen trong tế bào chất). Cỏc nhà khoa học trờn thế giới đó cú nhƣng cụng trỡnh nghiờn cứu kinh điển về sự di truyền phõn tử tớnh chống chịu mặn. Dựa vào bản đồ QTL (quantitative trait loci) – bản đồ phõn tớch di truyền tớnh trạng số lƣợng, trờn cơ sở tớnh chống chịu mặn là tớnh trạng mục tiờu do đa gen điều khiển, sử dụng AFLP và STS marker cỏc nhà khoa học đó cho thấy gen chủ lực điều khiển tớnh trạng chống chịu mặn đƣợc định vị trờn Nhiễm sắc thể số 1 và đƣợc gọi là gen Saltol [8]. Bản đồ QTL (quantitative trait loci) đƣợc ỏp dụng trong trƣờng hợp những tớnh trạng mục tiờu do đa gen điều khiển (thớ dụ nhƣ tớnh chống chịu mặn). Di truyền số lƣợng truyền thống khụng thể phỏt hiện QTL trờn những loci riờng biệt gắn với tớnh trạng số lƣợng đang nghiờn cứu, vị trớ của nú trờn nhiễm sắc thể và liờn kết của nú với những gen khỏc. Bản đồ di truyền phõn tử với mật độ cao số lƣợng marker phủ trờn toàn bộ nhiễm thể trong genome cõy trồng sẽ cung cấp cho chỳng ta cụng
cụ cú khả năng nghiờn cứu tớnh trạng di truyền số lƣợng phức tạp, định vị gen trờn những nhiễm thể, và xỏc định cỏc gen mục tiờu liờn kết với gen khỏc [36].
Mục tiờu cơ bản của bản đồ QTL là tỡm hiểu cơ sở di truyền của những tớnh trạng số lƣợng bằng cỏch xỏc định số lƣợng, cỏc vị trớ, những ảnh hƣởng của gen, và hoạt động của những loci bao gồm tƣơng tỏc gen (epistasis) và tƣơng tỏc QTL x E (mụi trƣờng). Một mục đớch khỏc của bản đồ QTL là xỏc định những marker mang tớnh chẩn đoỏn đối với những kiểu hỡnh đặc thự nào đú, sao cho việc ỏp dụng MAS trở nờn cú hiệu qủa, phục vụ yờu cầu chọn dũng (giống) chống chịu khụ hạn, chống chịu mặn, v.v.. Mục tiờu lõu dài của thớ nghiệm về bản đồ QTL là “cloning” cỏc gen điều khiển tớnh trạng số lƣợng vụ cựng phức tạp, thụng qua tiếp cận kỹ thuật “map-based cloning” [104], [106]. Nguyờn tắc lập bản đồ QTL với marker phõn tử DNA là phỏt hiện cho đƣợc những kết hợp giữa marker và tớnh trạng trờn cơ sở liờn kết gen, thụng qua cỏc phƣơng phỏp bố trớ thớ nghiệm và phƣơng phỏp phõn tớch thống kờ chớnh xỏc. Quần thể phục vụ cho những yờu cầu nhƣ vậy thƣờng là: F2, hồi giao (BC), đơn bội kộp (DH), hoặc cận giao tỏi tổ hợp (RIL) từ một tổ hợp lai giữa hai dũng cận giao, phõn ly những tớnh trạng số lƣợng mục tiờu và nhiều marker đi kốm theo. Quần thể này phải đƣợc đỏnh giỏ kiểu hỡnh rất đầy đủ, và đƣợc đỏnh giỏ kiểu gen thụng qua bản đồ liờn kết gen với mật độ marker phủ trờn nhiễm thể dày đặc [83].