III. NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.4.2.2.Phương phỏp kiểm tra vi sinh vật cú trong thịt
3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.2.2.Phương phỏp kiểm tra vi sinh vật cú trong thịt
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 38
Xỏc ủịnh tổng số vi khuẩn hiếu khớ (TCVN – 5667, 1992) [42]; lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN – 4833 – 1 ữ 2, 2002) [43].
- Nguyờn lý: Trờn mụi trường thạch thường, ở ủiều kiện hiếu khớ, ở 37oC, trong 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phỏt triển riờng rẽ là một ủiểm xuất phỏt của vi khuẩn. ðếm số khuẩn lạc trờn ủĩa thạch chớnh là số vi khuẩn chứa trong mẫu phõn tớch.
- Chuẩn bị mẫu: Cõn 25g thịt ( loại bỏ mỡ, gõn, bạc nhạc) cho vào tỳi P.E chuyờn dụng vụ trựng, bổ sung thờm 225ml dung dịch ủệm Peptone. ðồng nhất mẫu bằng mỏy Stomacher trong 1 phỳt. Hỗn dịch thu ủược cú tỷ lệ mẫu pha loóng 10-1, từ mỗi dịch này cú thể pha loóng 10-2, 10-3,…. Tuỳ theo mức ủộ ủỏnh giỏ ụ nhiễm ủể xỏc ủịnh mức pha loóng.
- Phương phỏp nuụi cấy: Với 1 mẫu kiểm nghiệm phải nuụi cấy ớt nhất 3 ủậm ủộ, mỗi ủậm ủộ cấy vào 2 ủĩa thạch riờng. Lấy 1ml dung dịch ủồng nhất mẫu pha loóng ở những ủậm ủộ khỏc nhau ủể chuyển vào ủĩa Petri. ðổ vào mỗi ủĩa 12 - 15ml mụi trường thạch PCA (Plate Count Agar) hồ tan (ủó ủược hấp vụ khuẩn, ủể nguội 45oC), trộn ủều bằng cỏch xoay nhẹ ủĩa 1 - 2 vũng theo chiều kim ủồng hồ và ngược lại. ðể ủĩa thạch ủụng tự nhiờn trờn mặt phẳng nằm ngang, sau ủú lật ngược ủĩa chuyển vào tủ ấm 37oC, trong 24 giờ ủọc kết quả.
- Tớnh kết quả: ðếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trờn ủĩa thạch. ðể trỏnh nhầm lẫn cần ủưa ủĩa thạch lờn giỏ kớnh chia ụ ủể ủếm. Nếu vượt quỏ 300 khuẩn lạc/ủĩa Petri thỡ loại bỏ và mẫu cần ủược pha loóng tiếp.
Tổng số vi khuẩn hiếu khớ trong 1g thịt ủược tớnh theo cụng thức sau:
N = d W W C ) 1 . 0 ( 1+ 2 ∑
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 39
Trong ủú:
N: Số khuẩn lạc trong 1gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phõn giữa 1,0 - 9,0 x 10w (W là chữ số mũ thớch hợp của 10).
C: Số khuẩn lạc ủếm ủược trờn cỏc ủĩa ủó chọn.
W1, W2: Số ủĩa ở 2 ủộ pha loóng liờn tiếp ủó chọn thứ nhất và thứ 2. d: Hệ số của ủậm ủộ pha loóng ủó chọn thứ nhất.
* Phương phỏp xỏc ủịnh vi khuẩn E.coli trong 1gram thịt.
Xỏc ủịnh vi khuẩn E.coli (TCVN – 5155, 1990) [38]; lấy mẫu (TCVN –
5153, 1990) [37].
- Nguyờn lý: Dựa vào ủặc ủiểm E.coli phỏt triển tốt ở cỏc ủiều kiện 42oC trờn mụi trường CLP (canh thang Lactocose ủỏ phenol) và khuẩn lạc E.coli cú màu ỏnh kim trờn mụi trường Endo.
- Phương phỏp nuụi cấy: Mẫu pha loóng ở cỏc ủậm ủộ khỏc nhau: 10-1, 10-2, 10-3,…. Tuỳ theo dự toỏn mức ủộ ụ nhiễm. Mỗi ủậm ủộ pha loóng nuụi cấy 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 5ml mụi trường CLP, ủể tủ ấm 42oC, 24 - 48 giờ.
ðọc kết quả: Sau 24 - 48 giờ cỏc ống mụi trường chuyển từ màu hồng ủỏ sang màu vàng và sinh hơi trong ống Durham, từ cỏc ống CLP dương tớnh ria cấy chuyển sang mụi trường thạch Endo ủể tủ ấm 42oC, 24 giờ, khuẩn lạc E.coli cú màu ỏnh kim.
Dựng hệ thống phản ứng IMVIC ủể ủịnh danh vi khuẩn:
+ Phản ứng ủỏ Methyl: dương tớnh (M+), mụi trường cú màu ủỏ. + Phản ứng Indol: (I+), mụi trường cú màu ủỏ.
+ Phản ứng Simmons – Citrat: õm tớnh (C-).
+ Phản ứng Voges - prokauer: õm tớnh (V-), khụng màu, hoặc màu vàng. Kết quả thu ủược tớnh theo cụng thức sau:
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 40
1 1 X (vk/g) = số khuẩn lạc ủếm ủược x x
Khối lượng mẫu Bội số pha loóng Nuụi cấy mẫu thử * Phương phỏp xỏc ủịnh khuẩn Salmonella cú trong 25 gram thịt
Xỏc ủịnh vi khuẩn Salmonella ( TCVN - 5153, 1990) [37]; FAO (1992)
[55]. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu ( TCVN - 4833 - 1 ữ 2,2002) [43].
- Nuụi cấy tăng sinh: Cõn 25g thịt (loại bỏ mỡ, gõn, bạc nhạc) nghiền nhuyễn trong cối sứ, sau ủú cho vào bỡnh tam giỏc vụ trựng cú chứa 225 ml mụi trường Selenit, ủể tủ ấm 37oC, 24 giờ.
- Phõn lập trờn mụi trường chọn lọc: Dựng que cấy vụ trựng, ria cấy canh trựng từ mụi trường tăng sinh sang mụi trường thạch Brillitant green và Mac conkey những khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella thường mọc thành những khuẩn lạc trũn, trong, khụng màu, nhẵn búng và hơi lồi giữa. Trờn mụi trường thạch Brillitant green những khuẩn lạc như Salmonella cú màu hồng, nhỏ, trong trờn
nền ủỏ sang. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kiểm tra ủặc tớnh sinh hoỏ của vi khuẩn Salmonella.
+ Nuụi cấy trờn mụi trường mụi trường tam sắt (TSI): lấy khuẩn lạc nghi ngờ trờn mụi trường chọn lọc cấy chuyển sang mụi trường TSI theo phương phỏp cấy trớch sõu, ủể tủ ấm 37oC, 24 giờ, ủọc kết quả. Nếu là vi khuẩn Salmonella
mặc nghiờng ống mụi trường TSI cú màu ủỏ (nghĩa là khụng phõn giải Lactose và sucrose); thõn và ủỏy cú màu vàng, cú bọt khớ và vết nứt (phõn giải Glucose, sinh hơi); cú màu ủen (sinh H2S).
+ Nuụi cấy trờn mụi trường lysin decarboxylase: phản ứng dương tớnh cú màu tớm, õm tớnh màu vàng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 41
+ Nuụi cấy trờn mụi trường urờ (Christensen): cấy trờn mặt nghiờng thạch, ủ 37oC, 24 giờ, Salmonella cú phản ứng õm tớnh, mụi trường khụng chuyển màu (dương tớnh màu ủỏ).
+ Phản ứng Indol: Nuụi cấy vi khuẩn vào mụi trường Peptone, ủ 37oC, 24 - 48 giờ, sau ủú nhỏ vào 1ml thuốc thử, ủọc kết quả. Salmonella cú phản ứng õm tớnh, màu vàng nhạt, dương tớnh màu ủỏ.
+ Phản ứng VP (Voges – Proskauner): Cấy vi khuẩn vào mụi trường peptone glucose, ủ 37oC, 48 giờ. Chuyển 1ml canh trựng và một ống nghiệm khỏc, bổ sung 0,6ml dung dịch cồn Anpha naptol và 0,2ml Kalihydroxyt 40%, lắc và ủọc kết quả sau 5 - 15 phỳt. Salmonella cú phản ứng õm tớnh khụng màu hoặc vàng nhạt, dương tớnh màu ủỏ.
+ Phản ứng β - Galactosidase (O.N.P.G): nhỏ 1 giọt Toluen vào ống nghiệm chứa hỗn dịch 0,25ml nước muối ủẳng trương với khuẩn lạc, lắc ủều ủ cỏch thuỷ 37oC, 15 phỳt, nhỏ tiếp 0,25ml thuốc thử lắc ủều, ủ cỏch thuỷ 37oC, 24 giờ, Salmonella phản ứng õm tớnh khụng chuyển màu, dương tớnh màu vàng.
Chọn khuẩn lạc ủiển hỡnh cú thể giỏm ủịnh bằng phản ứng ngưng kết với khỏng nguyờn.
* Phương phỏp xỏc ủịnh và tớnh vi khuẩn Staphylococcus aureus cú trong 1gram thịt.
Xỏc ủịnh khuẩn Staphylococcus aureus (TCVN - 5156, 1990) [39]; lấy mẫu (TCVN - 5153, 1990) [37].
Chuẩn bị mẫu: Cõn 25g cho vào bỡnh hoỏ lỏng vụ trựng, thờm 225ml dung dịch pha loóng pepton, trộn ủều trong 1 - 2 phỳt ở tốc ủộ 10.000 - 12.000 vũng/phỳt. Sử dụng dung dịch pha loóng liờn tục từ 10-6 - 10-7 bằng cỏch di chuyển liờn tục 10ml của dung dịch pha loóng trước vào bỡnh chứa 90ml pepton.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 42
- Phương phỏp nuụi cấy: lấy 1ml dung dịch pha loóng ở mỗi ủậm ủộ cần kiểm tra cho vào trung tõm ủĩa thạch Baird parker ủó ủược hong khụ, xoay và nghiờng ủều về cỏc phớa ủể dung dịch ủều trờn mặt thạch, lật ỳp ủĩa thạch, ủể vào tủ ấm 37oC ± 1oC, trong 24 - 48 giờ. Mỗi ủậm ủộ cấy vào 2 ủĩa thạch.
Sau ủú lựa chọn cỏc ủĩa thạch cú từ 30 - 300 khuẩn lạc màu ủen, lồi, trũn, bờ ủều, cú vũng trong suốt sung quanh. Sử dụng mỏy ủếm khuẩn lạc ủể ủếm số khuẩn lạc nghi ngờ.
- Giỏm ủịnh Staphylococcus aureus bằng cỏch thực hiện cỏc phộp thử
kiểm tra ủặc tớnh làm ủụng huyết tương của vi khuẩn.
+ Phản ứng ủụng vún trờn phiến kớnh: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý trờn phiến kớnh, dung que cấy lấy vi khuẩn vừa ủủ trộn thành huyễn dịch ủục ủều, nhỏ tiếp một giọt huyết tương vào (thớ nghiệm ủối chứng một giọt nước muối sinh lý, một giọt huyết tương), sau ủú ủọc kết quả quan sỏt khả năng ủụng huyết tương trờn phiến kớnh bằng kớnh hiển vi.
+ Phản ứng ủụng vún trong ống nghiệm: chọn mỗi loại 5 khuẩn lạc nghi ngờ Staphylococcus aureus nuụi cấy trong mụi trường BHI, ủể tủ ấm 35 - 37oC, trong vũng 20 - 24 giờ. Sau ủú lấy canh trựng cho vào huyết tương theo tỷ lệ 1: 3 (0,1ml canh trựng với 0,3ml huyết tương thỏ), ủể tủ ấm 37oC trong 2, 4, 6, 8 - 24 giờ và ủọc kết quả. Nuụi cấy trờn mụi trường thạch Chapman, khuẩn lạc
Staphylococcus aureus trũn, hơi ủục, mặt nhẵn, viền mộp gọn, màu vàng.
Kết quả thu ủược như sau:
1 1
X (vk/g) = số khuẩn lạc ủếm ủược x x
Khối lượng mẫu Bội số pha loóng nuụi cấy mẫu thử
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 43 ðỏnh giỏ kết quả theo Sperber và Tantini
Huyết tương ủụng cứng sau 4 - 6
giờ khú di ủộng 4(+)
Xỏc ủịnh là Staphylococcus aureus
Huyết tương ủụng chắc sau 24 giờ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dễ di ủộng 3(+)
Khụng ủược xem là Staphylococcus aureus
Huyết tương ủụng thành cục nhỏ
sau 24 giờ 2(+)
Khụng xem ủược là Staphylococcus aureus
Huyết tương ủụng thành cục nhỏ
khụng liờn kết thành khối 1(+)
Khụng xem ủược là Staphylococcus aureus