III. NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.4. Phương phỏp nghiờn cứ u
3.4.1. Phương phỏp ủiều tra
- Lập cỏc phiếu ủiều tra về cỏc cơ sở giết mổ gia sỳc, gia cầm và tỡnh hỡnh quy hoạch, quản lý cỏc cơ sở giết mổ.
- điều tra thực trạng một số cơ sở giết mổ gia sỳc: ủối với cơ sở giết mổ gia sỳc cú cụng suất giết mổ từ 2con/ngày trở lờn
- điều tra thực trạng một số cơ sở giết mổ gia cầm tập trung, cỏc ủiểm giết mổ gia cầm tại cỏc chợ, nhà hàng cú cụng suất giết mổ từ 10 con/ngày trở lờn.
3.4.2. Phương phỏp xột nghiệm
3.4.2.1. Phương phỏp kiểm tra vi khuẩn cú trong nước sử dụng cho giết mổ.
Sử dụng phương phỏp lấy mẫu và xột nghiệm vi khuẩn nguồn nước theo quy trỡnh của Viện y học lao ủộng và vệ sinh mụi trường (2002) và tiờu chuẩn Việt Nam 2680 (TCVN, 1978) [36].
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 36
* Phương phỏp lấy mẫu
- Lấy mẫu nước mỏy tại vũi nước mỏy: Cần mở nước chảy hết cỡ trong vũi 2 - 3 phỳt. đúng vũi và khử khuẩn kỹ vũi nước bằng nhiệt ủộ bụng cồn. Mở vũi nước cho chảy mạnh 1 - 2 phỳt rồi ủiều chỉnh chảy vừa ủủ ủể lấy mẫu vào chai nỳt mài 500ml ủó ủược hấp, sấy tiệt trựng. Thao tỏc lấy mẫu cần phải ủảm bảo vụ trựng, mẫu phải bảo quản lạnh sau ủú chuyển về phũng thớ nghiệm.
- Lấy mẫu tại bể chứa: Khử trựng giỏ cõy Inox bằng cồn 70o, sau ủú ủặt chai nỳt mài 500ml (ủó ủược hấp, sấy tiệt trựng) cú buộc dõy ở nắp vào cõy giỏ treo. Thả chai lấy mẫu xuống ủộ sõu khoảng 0,3 - 0,5m, dật dõy nỳt mài ủể nước chảy vào ủầy chai thỡ kộo lờn, nghiờng cõy giỏ ủổ bớt phần nước trong chai mẫu, ủậy nỳt mài và ghi nhón lấy mẫu. Bao gúi, bảo quản lạnh và ủưa mẫu về phũng thớ nghiệm.
* Phương phỏp xỏc ủịnh vi khuẩn hiếu khớ
Sử dụng phương phỏp rút thạch ủể xỏc ủịnh vi khuẩn. Mẫu nước ủược pha loóng ở cỏc ủậm ủộ khỏc nhau: 10-1, 10-2, 10-3,Ầ Tuỳ theo ủộ sạch bẩn ủể quyết ủịnh mức ủộ pha loóng. Sử dụng pipet vụ trựng chuyển 1ml nước mẫu pha loóng vào giữa ủĩa Petri, mỗi ủộ pha loóng cấy vào hai ủĩa. Rút vào mỗi ủĩa pha loóng 12 - 15ml mụi trường thạch thường 45oC, xoay trũn ủĩa theo chiều kim ủồng hồ, sau ủú xoay ngược lại ủể trộn ủều mụi trường với mẫu nước kiểm tra. để ủĩa thạch ủụng tự nhiờn, ỳp ủĩa Petri chuyển vào tủấm 37oC trong 24 giờ.
đếm số khuẩn lạc mọc trờn bề mặt ủĩa thạch. để trỏnh nhầm lẫn cần ủưa ủĩa thạch lờn giỏ kớnh chia ụ ủể ủếm. Nếu vượt quỏ 300 khuẩn lạc/ủĩa Petri thỡ loại bỏ vào mẫu cần ủược pha loóng tiếp.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 37 N (vk/1ml) = n D C B A+10 +100 +1000
Trong ủú: N: số lượng vi khuẩn trong 1ml nước
A: số lượng lạc trong 1ml nước nguyờn khụng pha loóng B: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ởủộ pha loóng 10-1 C: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ởủộ pha loóng 10-2 D: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ởủộ pha loóng 10-3 n: độủậm pha loóng
* Phương phỏp xỏc ủịnh vi khuẩn E.coli
- Sử dụng phương phỏp lờn men nhiều ống và tớnh kết quả số lượng E.coli
bằng cỏch tra bảng tỡm số gần ủỳng MPN (Most Probable Number).
- Mẫu pha ở cỏc ủộ ủậm khỏc nhau: 10-1, 10-2, 10-3,Ầ Tuỳ theo ủộ sạch bẩn. Thụng thường một mẫu nuụi cấy ở 3 ủậm ủộ liờn tiếp.
- Mỗi ủộ pha loóng phải nuụi cấy 5 ống mụi trường canh thang CLP, ủể tủ ấm 42oC trong 24 giờ. Sau ủú cỏc ống mụi trường chuyển màu từ hồng ủỏ sang màu vàng và sinh hơi trong ống Durham thỡ ria cấy chuyển sang thạch Endo ủể tủấm 42oC trong 24 giờ.
Trờn mụi trường Endo khuẩn lạc xuất hiện màu ỏnh kim, ủú cú thể là khuẩn lạc E.coli cú nguồn gốc từ phõn. Làm phản ứng IMVIC ủể xỏc ủịnh vi khuẩn.
Tớnh kết quả: Ghi chộp số lượng cỏc ống dương tớnh, tra bảng MPN tớnh sốE.coli trong một lớt nước (Coliindex).
3.4.2.2. Phương phỏp kiểm tra vi sinh vật cú trong thịt
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 38
Xỏc ủịnh tổng số vi khuẩn hiếu khớ (TCVN Ờ 5667, 1992) [42]; lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN Ờ 4833 Ờ 1 ữ 2, 2002) [43].
- Nguyờn lý: Trờn mụi trường thạch thường, ở ủiều kiện hiếu khớ, ở 37oC, trong 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phỏt triển riờng rẽ là một ủiểm xuất phỏt của vi khuẩn. đếm số khuẩn lạc trờn ủĩa thạch chớnh là số vi khuẩn chứa trong mẫu phõn tớch.
- Chuẩn bị mẫu: Cõn 25g thịt ( loại bỏ mỡ, gõn, bạc nhạc) cho vào tỳi P.E chuyờn dụng vụ trựng, bổ sung thờm 225ml dung dịch ủệm Peptone. đồng nhất mẫu bằng mỏy Stomacher trong 1 phỳt. Hỗn dịch thu ủược cú tỷ lệ mẫu pha loóng 10-1, từ mỗi dịch này cú thể pha loóng 10-2, 10-3,Ầ. Tuỳ theo mức ủộủỏnh giỏ ụ nhiễm ủể xỏc ủịnh mức pha loóng.
- Phương phỏp nuụi cấy: Với 1 mẫu kiểm nghiệm phải nuụi cấy ớt nhất 3 ủậm ủộ, mỗi ủậm ủộ cấy vào 2 ủĩa thạch riờng. Lấy 1ml dung dịch ủồng nhất mẫu pha loóng ở những ủậm ủộ khỏc nhau ủể chuyển vào ủĩa Petri. đổ vào mỗi ủĩa 12 - 15ml mụi trường thạch PCA (Plate Count Agar) hoà tan (ủó ủược hấp vụ khuẩn, ủể nguội 45oC), trộn ủều bằng cỏch xoay nhẹ ủĩa 1 - 2 vũng theo chiều kim ủồng hồ và ngược lại. để ủĩa thạch ủụng tự nhiờn trờn mặt phẳng nằm ngang, sau ủú lật ngược ủĩa chuyển vào tủấm 37oC, trong 24 giờủọc kết quả.
- Tớnh kết quả: đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trờn ủĩa thạch. để trỏnh nhầm lẫn cần ủưa ủĩa thạch lờn giỏ kớnh chia ụ ủể ủếm. Nếu vượt quỏ 300 khuẩn lạc/ủĩa Petri thỡ loại bỏ và mẫu cần ủược pha loóng tiếp.
Tổng số vi khuẩn hiếu khớ trong 1g thịt ủược tớnh theo cụng thức sau:
N = d W W C ) 1 . 0 ( 1+ 2 ∑
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 39
Trong ủú:
N: Số khuẩn lạc trong 1gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phõn giữa 1,0 - 9,0 x 10w (W là chữ số mũ thớch hợp của 10).
C: Số khuẩn lạc ủếm ủược trờn cỏc ủĩa ủó chọn.
W1, W2: Sốủĩa ở 2 ủộ pha loóng liờn tiếp ủó chọn thứ nhất và thứ 2. d: Hệ số của ủậm ủộ pha loóng ủó chọn thứ nhất.
* Phương phỏp xỏc ủịnh vi khuẩn E.coli trong 1gram thịt.
Xỏc ủịnh vi khuẩn E.coli (TCVN Ờ 5155, 1990) [38]; lấy mẫu (TCVN Ờ 5153, 1990) [37].
- Nguyờn lý: Dựa vào ủặc ủiểm E.coli phỏt triển tốt ở cỏc ủiều kiện 42oC trờn mụi trường CLP (canh thang Lactocose ủỏ phenol) và khuẩn lạc E.coli cú màu ỏnh kim trờn mụi trường Endo.
- Phương phỏp nuụi cấy: Mẫu pha loóng ở cỏc ủậm ủộ khỏc nhau: 10-1, 10-2, 10-3,Ầ. Tuỳ theo dự toỏn mức ủộ ụ nhiễm. Mỗi ủậm ủộ pha loóng nuụi cấy 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 5ml mụi trường CLP, ủể tủấm 42oC, 24 - 48 giờ.
đọc kết quả: Sau 24 - 48 giờ cỏc ống mụi trường chuyển từ màu hồng ủỏ sang màu vàng và sinh hơi trong ống Durham, từ cỏc ống CLP dương tớnh ria cấy chuyển sang mụi trường thạch Endo ủể tủ ấm 42oC, 24 giờ, khuẩn lạc E.coli
cú màu ỏnh kim.
Dựng hệ thống phản ứng IMVIC ủểủịnh danh vi khuẩn:
+ Phản ứng ủỏ Methyl: dương tớnh (M+), mụi trường cú màu ủỏ. + Phản ứng Indol: (I+), mụi trường cú màu ủỏ.
+ Phản ứng Simmons Ờ Citrat: õm tớnh (C-).
+ Phản ứng Voges - prokauer: õm tớnh (V-), khụng màu, hoặc màu vàng. Kết quả thu ủược tớnh theo cụng thức sau:
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 40
1 1 X (vk/g) = số khuẩn lạc ủếm ủược x x
Khối lượng mẫu Bội số pha loóng Nuụi cấy mẫu thử * Phương phỏp xỏc ủịnh khuẩn Salmonella cú trong 25 gram thịt
Xỏc ủịnh vi khuẩn Salmonella ( TCVN - 5153, 1990) [37]; FAO (1992) [55]. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu ( TCVN - 4833 - 1 ữ 2,2002) [43].
- Nuụi cấy tăng sinh: Cõn 25g thịt (loại bỏ mỡ, gõn, bạc nhạc) nghiền nhuyễn trong cối sứ, sau ủú cho vào bỡnh tam giỏc vụ trựng cú chứa 225 ml mụi trường Selenit, ủể tủấm 37oC, 24 giờ.
- Phõn lập trờn mụi trường chọn lọc: Dựng que cấy vụ trựng, ria cấy canh trựng từ mụi trường tăng sinh sang mụi trường thạch Brillitant green và Mac conkey những khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella thường mọc thành những khuẩn lạc trũn, trong, khụng màu, nhẵn búng và hơi lồi giữa. Trờn mụi trường thạch Brillitant green những khuẩn lạc như Salmonella cú màu hồng, nhỏ, trong trờn nền ủỏ sang.
- Kiểm tra ủặc tớnh sinh hoỏ của vi khuẩn Salmonella.
+ Nuụi cấy trờn mụi trường mụi trường tam sắt (TSI): lấy khuẩn lạc nghi ngờ trờn mụi trường chọn lọc cấy chuyển sang mụi trường TSI theo phương phỏp cấy trớch sõu, ủể tủ ấm 37oC, 24 giờ, ủọc kết quả. Nếu là vi khuẩn Salmonella
mặc nghiờng ống mụi trường TSI cú màu ủỏ (nghĩa là khụng phõn giải Lactose và sucrose); thõn và ủỏy cú màu vàng, cú bọt khớ và vết nứt (phõn giải Glucose, sinh hơi); cú màu ủen (sinh H2S).
+ Nuụi cấy trờn mụi trường lysin decarboxylase: phản ứng dương tớnh cú màu tớm, õm tớnh màu vàng.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 41
+ Nuụi cấy trờn mụi trường urờ (Christensen): cấy trờn mặt nghiờng thạch, ủ 37oC, 24 giờ, Salmonella cú phản ứng õm tớnh, mụi trường khụng chuyển màu (dương tớnh màu ủỏ).
+ Phản ứng Indol: Nuụi cấy vi khuẩn vào mụi trường Peptone, ủ 37oC, 24 - 48 giờ, sau ủú nhỏ vào 1ml thuốc thử, ủọc kết quả. Salmonella cú phản ứng õm tớnh, màu vàng nhạt, dương tớnh màu ủỏ.
+ Phản ứng VP (Voges Ờ Proskauner): Cấy vi khuẩn vào mụi trường peptone glucose, ủ 37oC, 48 giờ. Chuyển 1ml canh trựng và một ống nghiệm khỏc, bổ sung 0,6ml dung dịch cồn Anpha naptol và 0,2ml Kalihydroxyt 40%, lắc và ủọc kết quả sau 5 - 15 phỳt. Salmonella cú phản ứng õm tớnh khụng màu hoặc vàng nhạt, dương tớnh màu ủỏ.
+ Phản ứng β - Galactosidase (O.N.P.G): nhỏ 1 giọt Toluen vào ống nghiệm chứa hỗn dịch 0,25ml nước muối ủẳng trương với khuẩn lạc, lắc ủều ủ cỏch thuỷ 37oC, 15 phỳt, nhỏ tiếp 0,25ml thuốc thử lắc ủều, ủ cỏch thuỷ 37oC, 24 giờ, Salmonella phản ứng õm tớnh khụng chuyển màu, dương tớnh màu vàng.
Chọn khuẩn lạc ủiển hỡnh cú thể giỏm ủịnh bằng phản ứng ngưng kết với khỏng nguyờn.
* Phương phỏp xỏc ủịnh và tớnh vi khuẩn Staphylococcus aureus cú trong 1gram thịt.
Xỏc ủịnh khuẩn Staphylococcus aureus (TCVN - 5156, 1990) [39]; lấy mẫu (TCVN - 5153, 1990) [37].
Chuẩn bị mẫu: Cõn 25g cho vào bỡnh hoỏ lỏng vụ trựng, thờm 225ml dung dịch pha loóng pepton, trộn ủều trong 1 - 2 phỳt ở tốc ủộ 10.000 - 12.000 vũng/phỳt. Sử dụng dung dịch pha loóng liờn tục từ 10-6 - 10-7 bằng cỏch di chuyển liờn tục 10ml của dung dịch pha loóng trước vào bỡnh chứa 90ml pepton.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 42
- Phương phỏp nuụi cấy: lấy 1ml dung dịch pha loóng ở mỗi ủậm ủộ cần kiểm tra cho vào trung tõm ủĩa thạch Baird parker ủó ủược hong khụ, xoay và nghiờng ủều về cỏc phớa ủể dung dịch ủều trờn mặt thạch, lật ỳp ủĩa thạch, ủể vào tủấm 37oC ổ 1oC, trong 24 - 48 giờ. Mỗi ủậm ủộ cấy vào 2 ủĩa thạch.
Sau ủú lựa chọn cỏc ủĩa thạch cú từ 30 - 300 khuẩn lạc màu ủen, lồi, trũn, bờ ủều, cú vũng trong suốt sung quanh. Sử dụng mỏy ủếm khuẩn lạc ủể ủếm số khuẩn lạc nghi ngờ.
- Giỏm ủịnh Staphylococcus aureus bằng cỏch thực hiện cỏc phộp thử kiểm tra ủặc tớnh làm ủụng huyết tương của vi khuẩn.
+ Phản ứng ủụng vún trờn phiến kớnh: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý trờn phiến kớnh, dung que cấy lấy vi khuẩn vừa ủủ trộn thành huyễn dịch ủục ủều, nhỏ tiếp một giọt huyết tương vào (thớ nghiệm ủối chứng một giọt nước muối sinh lý, một giọt huyết tương), sau ủú ủọc kết quả quan sỏt khả năng ủụng huyết tương trờn phiến kớnh bằng kớnh hiển vi.
+ Phản ứng ủụng vún trong ống nghiệm: chọn mỗi loại 5 khuẩn lạc nghi ngờ Staphylococcus aureus nuụi cấy trong mụi trường BHI, ủể tủ ấm 35 - 37oC, trong vũng 20 - 24 giờ. Sau ủú lấy canh trựng cho vào huyết tương theo tỷ lệ 1: 3 (0,1ml canh trựng với 0,3ml huyết tương thỏ), ủể tủấm 37oC trong 2, 4, 6, 8 - 24 giờ và ủọc kết quả. Nuụi cấy trờn mụi trường thạch Chapman, khuẩn lạc
Staphylococcus aureus trũn, hơi ủục, mặt nhẵn, viền mộp gọn, màu vàng. Kết quả thu ủược như sau:
1 1
X (vk/g) = số khuẩn lạc ủếm ủược x x
Khối lượng mẫu Bội số pha loóng nuụi cấy mẫu thử
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 43 đỏnh giỏ kết quả theo Sperber và Tantini
Huyết tương ủụng cứng sau 4 - 6
giờ khú di ủộng 4(+)
Xỏc ủịnh là Staphylococcus aureus
Huyết tương ủụng chắc sau 24 giờ
dễ di ủộng 3(+)
Khụng ủược xem là Staphylococcus aureus
Huyết tương ủụng thành cục nhỏ
sau 24 giờ 2(+) Khụng xem ủược là Staphylococcus aureus Huyết tương ủụng thành cục nhỏ
khụng liờn kết thành khối 1(+)
Khụng xem ủược là Staphylococcus aureus
3.5. Cỏc chỉ tiờu theo dừi
- Tổ chức lấy mẫu thịt gia sỳc, gia cầm xột nghiệm cỏc chỉ tiờu vi sinh thịt: + Xỏc ủịnh mẫu: Lấy mẫu thịt gia sỳc, gia cầm ở một số cơ sở giết mổ tại 05 quận nội thành gửi xột nghiệm ủỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu vi sinh thịt. Căn cứ vào thực trạng giết mổ gia sỳc, gia cầm trờn ủịa bàn thành phố và số lượng mẫu, thực tế cỏc cơ sở giết mổ nhỏ lẻ, phõn tỏn (<20 con lợn, và giết mổ gia cầm ở chợ) cú số lượng nhiều, cỏc cơ sở giết mổ tập trung cú số lượng rất hạn chế, do ủú ủể ủảm bảo tớnh ủại diện cho nhúm, số lượng mẫu lấy ở mỗi nhúm cú khỏc nhau. Cụ thể:
Cơ sở giết mổ gia sỳc Cơ sở giết mổ gia cầm Loại mẫu Tổng số mẫu <20 con/ngày 30-50 con/ngày Tập trung Con/ngày ở chợ con/ngày Nhà hàng con/ngày Tập trung con/ngày Thịt lợn 55 25 20 10 Thịt GC 40 25 10 5 Cộng 95 25 20 10 25 10 5
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 44
- Cỏc phương phỏp xột nghiệm vi sinh thỳ y theo tiờu chuẩn Việt Nam và cú quy trỡnh xột nghiệm kốm theo:
TT Chỉ tiờu xột nghiệm Phương phỏp lấy mẫu Phương phỏp phõn tớch Cơ sởủỏnh giỏ 1 Tổng số VKHK TCVN 4833-1:2002 FAO 14/4-92 TCVN 7046-2002