- Nhiễm trùng viêm phổi, viêm màng não
1: sản phẩm PCR nhân dòng gen 16SrDNA chủng TB5.3 2: sản phẩm PCR nhân dòng gen 16S rDNA chủ ng VD
3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh chất kháng khuẩn
3.3.1.1. Ảnh hưởng của môi trường lên men
Trong công nghệ lên men, môi trường lên men đóng vai trò quan trọng. Một môi trường lên men tốt phải là môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh trưởng tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao. Để lựa chọn môi trường lên men đáp ứng được cả hai điều kiện trên, chúng tôi sử dụng 7 loại môi trường lên men cơ sở trong lên men XK sinh kháng sinh bao gồm: M1ASW, MN1ASW, A4H, MT72, TH4-47, MT7 và MT79.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49
2-5 ngày, thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch, VSV kiểm định là B. subtilis ATCC 6633, kết quả thể hiện ở Hình 3.8 và Hình 3.9.
Hình 3.8. Khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng VD111 trên các môi trường lên men
Hình 3.9. Khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng TB5.3 trên các môi trường lên men
Như vậy, trong 7 môi trường lên men cả hai chủng nghiên cứu là VD111 và TB5.3 lần lượt thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường A4H (17,5 mm) và M1ASW (31,5 mm). Kết quả này đã chứng tỏ các thành phần trong môi trường lên men có ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành chất kháng sinh của xạ khuẩn như nhiều nghiên cứu trước đã khẳng định (Ashadevi,2005; Xue-Chang Wu và cộng sự, 2007).
Với mục đích là lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh, hai môi trường A4H và M1ASW được chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50
3.3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường nhân giống
Đối với quá trình lên men xạ khuẩn sinh kháng sinh, giống là yếu tố quyết định, ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của sản phẩm. Cùng một chủng xạ khuẩn nhưng với cách nhân giống khác nhau sẽ dẫn đến hiệu suất lên men khác nhau. Sử dụng môi trường nhân giống thích hợp sẽ giúp cho các chủng xạ khuẩn tăng nhanh sinh khối, phát triển nhanh chóng và dần ổn định thích nghi trước khi được đưa vào quy trình lên men sinh chất kháng khuẩn ở giai đoạn sau.
Trong nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các môi trường Gause I, ISP 2 và MT48 làm môi trường nhân giống. Đây là các môi trường khá giàu dinh dưỡng, tạo điều kiện cho chủng xạ khuẩn phát triển tốt trước khi được đưa vào lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn. Kết quả xác định hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định B. subtilis ATCC 6633 và lượng sinh khối khô của hai chủng XK được trình bày trong Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Khả năng sinh chất kháng khuẩn và sinh khối của hai chủng XK VD111 và TB5.3 trên các môi trường nhân giống khác nhau
Môi trường VD111 TB5.3 VKK (mm) Sinh khối (mg/ml) VKK (mm) Sinh khối (mg/ml) MT48 14,2± 0,1 3,083 21,2 3,072 ISP2 16,7± 0,1 6,222 27,9 5,969 Gauze 1 8,3± 0,1 2,987 18,5 2,136
Kết quả cho thấy khi nhân giống trên môi trường ISP2 chuyển vào lên men lượng chất kháng khuẩn được sinh ra cao nhất đối với cả hai chủng XK nghiên cứu.
3.3.1.3. Ảnh hưởng của hàm lượng các nguồn dinh dưỡng trong môi trường lên men
Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật luôn có thành phần hydratcacbon và nitơ, chúng được đưa vào môi trường nhằm cung cấp mạch cacbon cho quá trình tổng hợp và sự trao đổi hydratcacbon giúp cho vi sinh vật thu nhận năng lượng. Nguồn nitơđóng vai trò là thành phần nguyên liệu cho sự tổng hợp các sản phẩm của tế bào, ngoài ra các hợp chất chứa nitơ còn giúp tế bào thực hiện quá trình trao đổi chất và điều hòa các quá trình chuyển hóa. Do vậy hàm lượng các nguồn dinh dưỡng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51
này có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tổng hợp chất kháng sinh trong quá trình lên men XK. Những hiểu biết về thành phần môi trường lên men có ý nghĩa to lớn trong điều khiển quá trình lên men nhằm duy trì trạng thái hoạt động và có thể kéo dài pha sinh tổng hợp kháng sinh của chủng sản xuất, đặc biệt là lên men quy mô lớn.
Trên cơ sở môi trường lên men đã lựa chọn được cho chủng VD111 là A4H (Glucose 15 g/l; Bột đậu tương 15 g/l; NaCl 5 g/l; CaCO3 1 g/l; pH 7) và chủng TB5.3 là M1ASW (Tinh bột tan 10 g/l; Cao nấm men 4 g/l; Peptone 2 g/l) chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng glucose, bột đậu tương, tinh bột tan, cao nấm men và peptone tới khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn. Chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng trong các thí nghiệm là B. subtilis ATCC 6633. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.12.
Bảng 3.12 . Ảnh hưởng của hàm lượng nguồn dinh dưỡng tới khả năng sinh chất kháng khuẩn của hai chủng XK VD111 và TB5.3
Nguồn dinh dưỡng trong môi trường A4H cho chủng VD111 Glucose Hàm lượng (g/l) 5 10 15 20 25 VKK (mm) 10,8 ± 0,1 17,8 ± 0,1 13,5 ± 0,1 12,7 ± 0,1 0 Bột đậu tương Hàm lượng (g/l) 5 10 15 20 25 VKK (mm) 15,8 ± 0,1 17,9 ± 0,1 19,3 ± 0,1 17,5 ± 0,1 15,7 ± 0,1
Nguồn dinh dưỡng trong môi trường M1ASW cho chủng TB5.3 Tinh bột tan Hàm lượng (g/l) 6 8 10 12 14 VKK (mm) 18,3 28,1 30,2 33,7 14,4 Peptone Hàm lượng (g/l) 1 2 3 4 5 VKK (mm) 27 30,5 33 32,1 31,4 Cao nấm men Hàm lượng (g/l) 1 2 3 4 5 VKK (mm) 27 29,1 31,5 30,2 29,5
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52
Số liệu được trình bày ở Bảng 3.12 cho thấy, lên men chủng xạ khuẩn VD111 trên môi trường A4H có hàm lượng glucose 10 g/l, bột đậu tương 15g/l cho vòng kháng khuẩn lớn nhất. Đối với chủng TB5.3 thì môi trường lên men thích hợp là M1ASW với hàm lượng tinh bột tan 12g/l, peptone 3g/l và cao nấm men 3g/l. Có thể do khi thay đổi hàm lượng các nguồn cacbon và nitơ trong môi trường sẽ dẫn tới hiện tượng ức chế hoặc tăng cường quá trình sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào như protease, amylase, từ đó ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của hai chủng XK biển nghiên cứu (Bérdy, 2005; Saadoun và cộng sự, 1999).
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng trong MT M1ASW đối với chủng TB5.3
a/ Tinh bột tan ; b/ Peptone; c/ Cao nấm men 3.3.1.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu, nhiệt độ nuôi 3.3.1.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu, nhiệt độ nuôi
Cùng với thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men thì các điều kiện nuôi cấy khác như nhiệt độ lên men, giá trị pH ban đầu cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của XK. Sống trong môi trường lỏng, XK chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự trao đổi chất và phát triển. Nếu pH không thích hợp, XK có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt. Đồng thời nhiệt độ cũng có ảnh hưởng rất lớn trong quá trình lên men. Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzyme của tế bào vi sinh vật. Nhiệt độ lên men quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến quá trình sinh chất kháng khuẩn được thực hiện trong khoảng pH 5-9 và ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành theo các mức nhiệt: 20; 25; 30; 35 (oC) đối với cả hai chủng XK nghiên cứu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên khả năng sinh chất kháng khuẩn của hai chủng XK VD111 và TB5.3
pH 5 6 7 8 9 VKK (mm) VD111 12,5±0,1 19,1±0,1 16,3±0,1 16,0±0,1 14,0±0,1 TB5.3 21,3±0,1 28,5±0,1 31,8±0,1 30,7±0,1 24,6±0,1 Nhiệt độ (oC) 20 25 30 35 VKK (mm) VD111 0 9,7 ± 0,1 20,5 ± 0,1 13,2 ± 0,1 TB5.3 0 18,5 ± 0,1 32,8 ± 0,1 20,1 ± 0,1
Kết quả từ Bảng 3.13 cho thấy khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng VD111 cao nhất ở pH 6,0 tương ứng với vòng kháng khuẩn kháng chủng B. subtilis
ATCC 6633 đạt 19,1 mm. Tương tự với chủng TB5.3 thu được vòng kháng khuẩn lớn nhất đạt 31,8 mm tại giá trị pH 7,0.
Việc lựa chọn được nhiệt độ nuôi cấy thích hợp có ý nghĩa rất lớn trong cả nghiên cứu cũng như thực tiễn sản xuất. Số liệu thu được từ Bảng 3.13 cho thấy khi nuôi hai chủng XK ở 30oC, cả hai chủng đều sinh trưởng mạnh và cho khả năng kháng khuẩn lớn nhất. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả của các công bố trước đây vềđiều kiện lên men XK sinh chất kháng sinh (Hotam và cộng sự, 2013; Gulve và Deshmukh, 2012).
3.3.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống và thời gian nhân giống
Tỷ lệ tiếp giống và thời gian nhân giống có ảnh hưởng không nhỏ đến thời gian lên men đặc biệt là với quy mô công nghiệp thì yếu tố này ảnh hưởng đáng kể giá trị kinh tế. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp hay thời gian nhân giống ngắn sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất tổng hợp kháng sinh thấp. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do XK phát triển nhanh làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt và sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng. Đồng thời khi kéo dài thời gian nhân giống, các tế bào XK đã bước qua pha logarit và bắt đầu pha cân bằng. Khi chuyển vào môi trường lên men, giống sẽ không phát triển mạnh, vì thế tích lũy sinh khối và kháng sinh sẽ kém.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54
Xuất phát từ các yếu tố trên kết hợp với tìm hiểu các nghiên cứu khác (Rahman, 2011; Sirisha, 2013) chúng tôi tiến hành lên men hai chủng XK nghiên cứu với các tỷ lệ tiếp giống: 2, 4, 5, 6, 8 (%) và thời gian nhân giống: 24, 36, 48, 60 (giờ). Kết quả thể hiện ở Bảng 3.14.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống và thời gian nhân giống đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của hai chủng XK VD111 và TB5.3
Tỷ lệ tiếp giống (%) 2 4 5 6 8 VKK (mm) VD111 8,1±0,1 15,8±0,1 24,3±0,1 20,5±0,1 11,5±0,1 TB5.3 23,7±0,1 32,5±0,1 34,8±0,1 30,2±0,1 20,9±0,1 Thời gian (giờ) 24 36 48 60 VKK (mm) VD111 18,2±0,1 26,1±0,1 28,5±0,1 19,3±0,1 TB5.3 19,5±0,1 25,2±0,1 35,6±0,1 22,7±0,1
Số liệu thu được cho thấy trong quá trình lên men của hai chủng XK VD111 và TB5.3, tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng mạnh đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn thu được cao nhất khi lượng giống tiếp vào là 5% với cả hai chủng XK nghiên cứu. Khi tỷ lệ này nhỏ hơn 5% thì khả năng sinh chất kháng khuẩn kém hơn, do giống cần có thời gian dài hơn để thích nghi với môi trường. Còn khi tỷ lệ này cao hơn 5%, hoạt tính giảm vì lượng giống quá lớn làm tiêu hao dinh dưỡng nhanh chóng dẫn tới thiếu dinh dưỡng cho quá trình tạo sản phẩm về sau.
Kết quả nghiên cứu về thời gian nhân giống của hai chủng XK cho thấy thời gian thích hợp là 48 giờ tương ứng với vòng kháng khuẩn lần lượt đạt 28,5 mm và 35,6 mm đối với hai chủng VD111 và TB5.3. Nếu thời gian nhân giống ngắn hơn, sinh khối tạo thành chưa nhiều, khi chuyển vào bình lên men thì giống phải mất thời gian thích nghi, lượng giống quá ít cũng làm giảm hiệu suất lên men.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55
Hình 3.11. Ảnh hưởng của một số điều kiện lên men đối với chủng VD111