VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5. Phân tích dịch chiết kháng khuẩn của hai chủng XK
2.3.5.1. Đánh giá khả năng ức chế nồng độ vi khuẩn tối thiểu (Determination of minimum bactericidal concentration - MBC)
Phương pháp MBC được sử dụng đểđánh giá khả năng ức chế nồng độ vi khuẩn tối thiểu của dịch chiết kháng khuẩn từ hai chủng TB5.3 và VD111 (Jennifer, 2001).
Các chủng VSV kiểm định được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng trên máy lắc tốc độ 200 v/phút ở nhiệt độ 37oC.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy các chủng sao cho mật độ tế bào lần lượt đạt: 107, 106, 105, 104, 103 CFU/ml. Sau đó, hút 5 µl dịch pha loãng nhỏ trên môi trường LB đã trang 100 µl dịch chiết kháng khuẩn. Ủ các đĩa thạch ở 4oC trong 4-5h rồi nuôi ở 37oC, quan sát kết quả sau 12h. Hai mẫu đối chứng gồm một đĩa petri chứa môi trường thạch đã trang 100 µl nước cất khử trùng và một đĩa trang dung môi chiết.
2.3.5.2. Sắc ký bản mỏng (TLC)
Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 10 cm đường kính miệng 5 cm, có nắp đậy kín. Rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ởđáy bình.
Ðậy kín nắp bình và để yên khoảng 20 – 30 phút ở nhiệt độ phIòng. Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60 F254 của hăng Merck được cắt thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 8 cm.
Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản để đưa dịch chiết lên bản mỏng dưới dạng điểm, thể tích dung dịch là 50 µl. Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6mm và cách nhau 1,5 cm. Các vết ở bìa phải cách mép của bản mỏng ít nhất 1cm để tránh hiệu ứng bờ.
Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn khoảng 5 cm (cách mép trên của bản sắc ký khoảng 1cm), lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi cho hiện màu dưới tia UV và hơi I ốt, đo khoảng dịch chuyển của dung môi và các chất cần tách. Tính hệ số Rf theo công thức:
Trong đó:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
lo: khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi
Như vậy Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1. Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi (Đào Hữu Vinh, 1985; Kealey và Haines, 2002; Gulvel và Deshmukh, 2012).
2.3.5.3. Sắc ký giấy
Sử dụng giấy sắc ký được cắt thành hình chữ nhật kích thước 1 cm x 8 cm. Giữ mép trên của giấy sắc ký tránh bị gập giấy trong quá trình chạy sắc ký. Các bước tiến hành cụ thể tương tự triển khai sắc ký bản mỏng.
Sau khi kết thúc quá trình chạy sắc ký, lấy giấy sắc ký ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên giấy. Đặt giấy sắc ký lên bề mặt môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong các đĩa petri rồi để các đĩa vào tủ lạnh 4oC trong vòng 4 - 5 giờđể chất kháng khuẩn khuếch tán, tiếp đó nuôi ở 28 – 30oC và đọc kết quả sau 12 giờ. Tính hệ số Rf theo công thức:
Trong đó:
l: đoạn đường đi của cấu tử lo: đoạn đường đi của dung môi.
Nếu Rf lớn quá thì không tách được các chất, Rf nhỏ quá thì tách chậm (Đào Hữu Vinh, 1985; Daniel, 2007; Gulvel và Deshmukh, 2012).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Chương 3